Protocole général pour la cytométrie en flux

Protocole général pour la cytométrie en flux









I. Matériels requis
Réactifs
- Un (ou plusieurs) anticorps Iaire couplé(s) ou non et spécifiques de votre(s) molécule(s) d’intérêt
- Un bloqueur des récepteurs Fc ou « Anti-CD16/32, block Fc binding » qui fixe l’anticorps primaire de façon aspécifique
- Un anticorps secondaire, dans le cas de marquages indirects avec un Ac primaire non couplé
- Un (ou plusieurs) isotypes contrôles non relevant(s) d’isotypes et de couplages identiques à ceux des anticorps primaires

Tampons
- Un tampon de marquage en cytométrie de flux ou « Staining Buffer »
- Bleu trypan pour le comptage des cellules ou « Trypan blue »
- Liquide de gaines pour le cytomètre en flux

Matériel - Des pipettes et un Pipet-aid
- Une centrifugeuse
- Un réfrigérateur ou de la glace
- Un cytomètre en flux


II. Durée de l’expérimentation
- 30 mn de préparation des échantillons et de l’anticorps (dilutions)
- 30 mn à 1 h d’incubation des anticorps selon la stratégie utilisée (marquage direct ou indirect)
- 30 mn à 1 h de lecture des cellules par le cytomètre de flux (selon le nombre d’échantillons, la concentration des cellules et les réglages du cytomètre)
- TOTAL : 2 à 3 heures


III. Mode opératoire
- Diluer l’anticorps primaire et l’isotype contrôle dans 50 µl de tampon de réaction afin d’obtenir la concentration désirée et validée au préalable par une titration (identique pour les deux Ac)
- Incuber 50 µl de la préparation cellulaire avec 50 µl de la préparation d’anticorps Iaire ou d’isotype contrôle dans une plaque 96 puits à fond U
- Agiter délicatement la plaque et incuber pendant 15-30 mn à 4°c et à l’obscurité

Note : Les anticorps ont des affinités différentes avec leur antigène et requièrent des temps d’incubation variables à optimiser au préalable.

- Ajouter 200 µl de tampon de réaction pour arrêter la réaction
- Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min (300 - 400g) à +4°c et enlever le surnageant.
- Répéter deux fois les lavages des cellules avec 200 µl de tampon de réaction et une centrifugation de la suspension cellulaire pendant 5 min (300 - 400g) à 4°c

Facultatif : En cas de marquage indirect, répéter les étapes de marquage avec l’anticorps secondaire avec le même protocole et les mêmes observations
- Resuspendre dans 500 µl de tampon de réaction ou du tampon de fixation complémenté à 2 % de formaldéhyde
- Lire les cellules marquées au cytomètre en flux


IV. Moteurs de recherches
- Anticorps primaires
- Anticorps secondaires, dans le cas de marquages indirects avec un Ac Iaire non couplé