Protocole pour la cytométrie en flux intracellulaire

Protocole pour la cytométrie en flux intracellulaire









I. Matériels requis
Réactifs
- Un anticorps primaire directement couplé spécifique de votre molécule(s) d’intérêt
- Un Anticorps secondaires, dans le cas de marquages indirects avec un Ac primaire non couplé
- Un (ou plusieurs) isotypes contrôles non relevant(s) d’isotypes et de couplages identiques à ceux des anticorps primaires

Tampons
- Un tampon de marquage en cytométrie de flux ou « Staining Buffer »
- Tampon de perméabilisation ou « Permeabilization Buffer »
- Tampon de fixation intracellulaire « IC Fixation Buffer »

Matériel
- Des pipettes et un Pipet-aid
- Une centrifugeuse
- Un réfrigérateur ou de la glace
- Un cytomètre en flux


II. Durée de l’expérimentation
- Stimulation des cellules (temps variable selon le modèle)
- 2 à 3 heures d’incubation des anticorps
- 30 mn à 1 h de lecture des cellules par le cytomètre de flux (selon nombre d’échantillons, concentration des cellules et les réglages du cytomètre)
- TOTAL : 3 à 4 heures


III. Mode opératoire
- Préparer les cellules selon un protocole dépendant de votre modèle
- Marquer les molécules de surface selon le protocole traditionnel de marquage des cellules en suspension
- Après le dernier lavage, fixer les cellules en ajoutant 100 µl de tampon de fixation puis vortexer
- Incuber 20 mn à température ambiante dans l’obscurité
- Centrifuger pendant 5 mn (300 – 400g) à 4°c
- Rajouter 1 ml de tampon de perméabilisation
- Centrifuger pendant 5 mn (300 – 400g) à 4°c
- Mettre 20 µl d’anticorps dilué à une concentration optimale (0,5 à 0,6 µg / 106 cellules) dans du tampon de perméabilisation et vortexer
- Incuber les tubes dans l’obscurité pendant 20 mn à température ambiante
- Ajouter 1 ml de tampon de perméabilisation
- Centrifuger pendant 5 mn (300 – 400g) à 4°c
- Resuspendre dans 500 µl de tampon de réaction ou du tampon de fixation complémenté à 2 % de formaldéhyde
- Lire les cellules marquées au cytomètre en flux


IV. Moteurs de recherches
- Anticorps primaires
- Anticorps secondaires, dans le cas de marquages indirects avec un Ac Iaire non couplé