Protocole général pour le Western Blot (WB)

Protocole général pour le Western Blot (WB)









I. Matériels requis
Réactifs
- Un anticorps primaire directement couplé spécifique de votre molécule(s) d’intérêt
- Un anticorps secondaire, dans le cas de marquages indirects avec un Ac primaire non couplé
- Solution de chimioluminescence pour Western Blot
- Tampon de transfert
- Solution de Ponseau

Tampons
- 4x SDS sample buffer (0.25M Tris-HCl pH 6.8, 8% SDS, 30% Glycerol, 0.02% Bromophenol Blue) containing a reducing agent (either 10% B-ME or 0.3M DTT) 
- 1X SDS Running Buffer made from 10x stock (30.3g tris, 144g Glycine, 10g SDS and make up to 1 L with water)
- 10X TBS (61g Tris, 90g NaCl, pH 7.6)
- Tris, Glycerol, Bromophenol Blue, B-ME, Glycine, SDS 
- Methanol, Tris, Glycine, Ponceau, acetic acid
- Tris, NaCl, lait en poudre, Tween-20

Material
- Pipettes et Pipet-aid
- Film autoradiographique


II. Experimentation length
- Chauffage des échantillons à 95-100C pendant 5 minutes
. Electrophorèse des protéines à 100V constant
. Transfert des protéines pendant 90 mn à 100V ou overnight à +4°C à 20V.
. Incubation de la membrane dans la solution de blocage pendant 1 heure à température ambiante
. Incubation de l’anticorps primaire à température ambiante pendant 2 heures dans 5% milk/TBST
. Incubation de la membrane avec l’anticorps secondaire pendant 1 heure à température ambiante
. Exposition de la membrane à un film autoradiographique pendant 1 mn à 1 heure selon l’intensité du signal attendu
- TOTAL : 6-8 heures


III. Protocole
- Electrophorèse de la protéine :
. Préparer les cellules/lysats
. Resuspendre qsp 10-20 µl dans du 4X SDS sample buffer
. Préparer le gel SDS-PAGE
. Placer le gel dans la chambre de migration et remplir avec du 1X SDS Running Buffer
. Chauffer les échantillons à 95-100°C pendant 5 minutes
. Charger 5 µl de l’échelle de poids moléculaire dans le premier puits
. Charger les échantillons bouillis
. Electrophorèse à 100V constants jusqu’à ce que le bleu de bromophénol atteigne le bas du gel

- Transfert de la protéine :
. Placer le gel dans le tampon de transfert
. Transférer le gel sur un papier filtre
. Assembler le filtre papier, le gel, la membrane (nitrocellulose / PVDF), le filtre papier et l’anode pour permettre le transfert de la protéine de la cathode vers l’anode
. Electrophorèse pendant 90 mn à 100V ou overnight à +4°C à 20V.

- Détection de la protéine :
. Incuber la membrane dans la blocking solution pendant une heure à température ambiante à +4°C overnight avec agitation
. Incuber l’anticorps primaire overnight ou à température ambiante pendant 2 heures dans 5% milk/TBST
. Enlever l’anticorps primaire et laver la membrane 3 fois pendant 5-15 minutes dans du TBST
. Incuber la membrane avec l’anticorps secondaire conjugué peroxydase pendant une heure à température ambiante dans 5% milk/TBST.
. Enlever l’anticorps secondaire et laver la membrane 3 fois pendant 5-15 minutes dans du TBST

- Protein Detection :
. Exposer la membrane en contact avec le film autoradiographique pendant 1 minute à 1 heure, selon l’intensité du signal attendu