Les spectrophotomètres sont des instruments analytiques fondamentaux largement utilisés en biochimie, en biologie moléculaire et en chimie analytique. Ces dispositifs permettent la détermination quantitative de la concentration de biomolécules en mesurant l’absorbance de la lumière traversant une solution d’échantillon. Cette mesure repose sur la loi de Beer–Lambert, qui établit une relation linéaire entre l’absorbance et la concentration d’une espèce chimique en solution.
Principe de fonctionnement
Les spectrophotomètres fonctionnent en générant une lumière polychromatique à l’aide de sources telles que des lampes au deutérium ou au tungstène, couvrant généralement une plage de longueurs d’onde d’environ 190 à 1100 nm. Le faisceau lumineux est ensuite séparé en longueurs d’onde spécifiques grâce à des systèmes optiques tels que des monochromateurs à réseau de diffraction présentant une bande passante d’environ 1 à 5 nm, ou au moyen de filtres optiques. La lumière monochromatique résultante traverse ensuite un échantillon contenu dans une cuvette en quartz, généralement avec un trajet optique de 1 cm.
Des détecteurs tels que des tubes photomultiplicateurs (PMT) ou des photodiodes en silicium mesurent l’intensité de la lumière incidente (I₀) et celle de la lumière transmise (I) après interaction avec l’échantillon. L’absorbance (A) est calculée selon l’équation de Beer–Lambert : A = log₁₀(I₀/I) = εcl, où ε représente le coefficient d’extinction molaire (M⁻¹·cm⁻¹), c la concentration de l’analyte (M) et l la longueur du trajet optique (cm). De nombreux instruments modernes utilisent des configurations à double faisceau, permettant la mesure simultanée du signal de l’échantillon et d’une référence afin d’améliorer la correction de la ligne de base et la stabilité des mesures.
Applications biochimiques
La spectrophotométrie joue un rôle essentiel dans de nombreuses applications en biochimie et en biologie moléculaire. Par exemple, la quantification des acides nucléiques repose fréquemment sur la mesure de l’absorbance à 260 nm, où une densité optique de 1,0 correspond approximativement à 33 µg/mL pour l’ADN simple brin. La pureté des préparations d’acides nucléiques est souvent évaluée à l’aide de rapports d’absorbance, tels que des valeurs A₂₆₀/A₂₈₀ supérieures à 1,8, indiquant généralement un ADN relativement pur.
La concentration des protéines peut être déterminée à l’aide d’analyses colorimétriques telles que le test de Bradford (595 nm), qui permet généralement de détecter des quantités de protéines comprises entre 1 et 10 µg, ou le test à l’acide bicinchoninique (BCA) (562 nm), qui permet une quantification sur des plages de concentration plus larges d’environ 20 à 2000 µg. Les mesures spectrophotométriques sont également largement utilisées dans l’étude de la cinétique enzymatique, par exemple en suivant l’oxydation ou la réduction du NADH à 340 nm lors de réactions catalysées par des déshydrogénases. En biologie cellulaire, des tests de viabilité tels que le test MTT mesurent l’activité métabolique par la réduction de sels de tétrazolium détectée autour de 570 nm. Par ailleurs, des rapports d’absorbance tels que A₂₆₀/A₂₃₀ permettent d’identifier la présence de contaminants, notamment des sels de guanidinium ou des composés organiques résiduels issus des procédures de purification des acides nucléiques.
