Hot-start NeoTaq II DNA polymerase
Katalog-Nummer NB-60-0008
Size : 500U
Marke : Neo Biotech
Datasheet (EN)
NeoTaq II-DNA-Polymerase mit Hot-Start-Funktion
Beschreibung
- Hot-start NeoTaq II DNA-Polymerase ist eine modifizierte DNA-Polymerase mit Hot-Start-ähnlicher PCR-Aktivität.
- Eine begrenzte Aktivität bei Raumtemperatur hilft, unspezifische Primerverlängerungen und Primer-Dimer-Bildungen zu verhindern.
- Liefert höhere PCR-Spezifität, Sensitivität und DNA-Ausbeute.
- Aktiviert in 5 Minuten bei 95°C für einen schnellen Reaktionsstart.
- Unterstützt die Amplifikation von DNA-Templates bis zu 6 kb mit schnellen Verlängerungszeiten von 15–30 s/kb.
- Erfordert minimale PCR-Optimierung und ermöglicht einen Reaktionsansatz bei Raumtemperatur.
- Hot-start NeoTaq II DNA-Polymerase besitzt keine 3′→5′-Exonukleaseaktivität (Korrekturleseaktivität).
- Erzeugt PCR-Produkte mit 3′-A-Overhangs, geeignet für TA-Klonierung mit PCR-Klonierungskits.
Lagerungsbedingungen und Reagenzienvorbereitung
Dieses Produkt sollte bei -85 °C bis -15 °C in einem Gefrierschrank ohne Abtauzyklen gelagert werden, um eine maximale Haltbarkeit zu gewährleisten. Das Produkt bleibt bei vorschriftsmäßiger Lagerung bis zum Verfallsdatum stabil.
Qualitätskontrolltest
Reinheit
Die Reinheit der Hot-start NeoTaq II DNA-Polymerase beträgt > 90 %, gemessen mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese gefolgt von Coomassie-Brilliant-Blau-Färbung.
Genomische DNA-Kontamination
Das Produkt muss internen Standards für DNA-Kontamination entsprechen, wie sie durch Echtzeit-qPCR evaluiert werden.
Nuklease-Assays
0,2–0,3 μg Plasmid-DNA werden mit 5 U Hot-start NeoTaq II DNA-Polymerase in 1×-Reaktionspuffer für 14–16 Stunden bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wird die DNA auf einem mit Safe DNA Gel Stain gefärbten Agarosegel visualisiert. Es darf keine sichtbare Strangtrennung oder Zersetzung der Nukleinsäure auftreten. Ähnliche Tests werden mit dem Hot-start NeoTaq II-Puffer und der MgCl2-Lösung durchgeführt.
Funktionstest
Die Hot-start NeoTaq II DNA-Polymerase wird ausgiebig auf ihre Leistung in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) von unterschiedlich großen DNA-Fragmenten (1 und 2,5 kb) aus humaner genomischer DNA getestet. Die resultierenden PCR-Produkte werden als einzelne Banden in einem mit Safe DNA Gel Stain gefärbten Agarosegel visualisiert. Ähnliche Funktionstests werden mit dem Hot-start NeoTaq II-Puffer und der MgCl2-Lösung durchgeführt.
Fehlerbehebung
Keine Produktamplifikation oder geringe Ausbeute
• Unangemessene Annealing-Temperatur
Die Zusammensetzung des Reaktionsmixes kann die Schmelzeigenschaften von Primern und DNA beeinflussen. Passen Sie die Annealing-Temperatur an den Primer mit der niedrigsten Schmelztemperatur an (5 °C bis 10 °C niedriger als Tm).
• Vorhandensein von PCR-Inhibitoren
Einige DNA-Isolierungsverfahren, insbesondere die Isolierung genomischer DNA, können zur Co-Aufreinigung von PCR-Inhibitoren führen. Reduzieren Sie das Volumen der Template-DNA im Ansatz oder verdünnen Sie die Template-DNA vor der Zugabe zum Ansatz. Sogar eine Verdünnung der Proben um 1:10.000 hat sich je nach Ausgangskonzentration der DNA als wirksam erwiesen, um die Ergebnisse zu verbessern.
• Erforderliche Zusatzstoffe
Die Zugabe von PCR-verstärkenden Wirkstoffen (5× Optimizer Solution oder 2× GC-Enhancer Solution) kann die Ausbeute verbessern und gleichzeitig die Amplifikation schwieriger Templates ermöglichen.
Vorhandensein unspezifischer Banden
• Unspezifisches Annealing von Primern
Passen Sie die Annealing-Bedingungen an und/oder entwerfen Sie einen neuen Satz von Primern, indem Sie die Länge erhöhen und komplementäre Sequenzen vermeiden.
• Mg2+-Konzentration ist zu hoch
Im Allgemeinen funktionieren 1,5–3 mM MgCl2, typischerweise 2,5 mM Endkonzentration, gut für die Mehrheit der PCR-Reaktionen. Die optimale Konzentration hängt von Ziel-Template, Puffer und dNTPs ab. Optimieren Sie die Magnesiumkonzentration, indem Sie MgCl2 in Schritten von 0,5 mM bis zu 4 mM ergänzen.