1. Defina exactamente lo que necesita detectar

Identifique la diana utilizando su nombre de gen/proteína y un identificador de acceso siempre que sea posible. Decida si necesita la proteína total, una isoforma particular, un producto de escisión o una modificación postraduccional específica. Para un anticuerpo fosfoespecífico, especifique el residuo y el contexto de secuencia relevante.

Compruebe el inmunógeno y el epítopo mapeado, cuando se divulguen, frente a la forma proteica presente en su modelo. Un anticuerpo que reconozca una región compartida puede detectar varias isoformas; una región ausente en una proteína truncada no puede informar sobre esa forma. Una descripción del inmunógeno por sí sola no demuestra especificidad en una muestra compleja. [4] [7]

Comprobación de selección: distinga lo que se anuncia que reconoce el anticuerpo de lo que los datos experimentales establecen realmente.

2. Separe la reactividad de la especie diana de la especie hospedadora del anticuerpo

La especie diana describe el origen del antígeno; la especie hospedadora describe el organismo en el que se generó originalmente el anticuerpo. Un anticuerpo generado en conejo puede reconocer una proteína humana. Compruebe la reactividad probada con su especie diana y distinga la evidencia experimental de las predicciones basadas en secuencias.

En modelos transfectados, especifique tanto la proteína introducida como la especie de fondo. Para la detección indirecta en tejido, considere las inmunoglobulinas endógenas: utilizar un anticuerpo primario de ratón en tejido de ratón, por ejemplo, puede producir fondo cuando un anticuerpo secundario anti-ratón también detecta las inmunoglobulinas tisulares. Es posible que se necesiten especies hospedadoras alternativas o una estrategia de tinción adecuada de la misma especie. [4]

Comprobación de selección: evalúe el reconocimiento de la diana y la compatibilidad con el sistema de detección como dos decisiones separadas.

3. Evalúe la evidencia específica de la aplicación, no solo una etiqueta de validación

Inspeccione las imágenes reales, los controles, la identidad de la muestra y el protocolo que respaldan la referencia. Un producto validado en Western blot no está validado por ello en IHC o citometría de flujo; incluso dentro de una misma aplicación, el rendimiento depende del contexto de la muestra y de las condiciones del ensayo. [1] [2]

Prefiera evidencia que muestre la detección de la diana endógena en una muestra relevante, respaldada por una estrategia de especificidad adecuada. El antígeno purificado o los datos de sobreexpresión pueden ser informativos, pero por sí solos pueden no establecer una detección selectiva a niveles de expresión endógena. El uso publicado es útil cuando los métodos y los controles coinciden con sus necesidades; el recuento de citas por sí solo es insuficiente. [4] [7]

Comprobación de selección: pregunte qué evidencia respalda exactamente el clon o preparación, la especie y la aplicación que pretende utilizar.

4. Adapte la accesibilidad del epítopo a la preparación de la muestra

La preparación puede enmascarar, exponer o alterar los epítopos. Compare su protocolo con las condiciones utilizadas para caracterizar el anticuerpo en lugar de confiar únicamente en la abreviatura de la aplicación. [5]

IHC: distinga el tejido FFPE del congelado y compare el fijador, las condiciones de fijación y la recuperación de antígenos. Western blot: compruebe la compatibilidad con condiciones desnaturalizantes frente a nativas, calentamiento y reducción. [4] [7] Citometría de flujo: la tinción de superficie en células vivas requiere un epítopo extracelular accesible. [8] La tinción intracelular convencional generalmente utiliza fijación y permeabilización; seleccione un clon y un conjugado compatibles con dichas condiciones. [8]

Comprobación de selección: busque datos obtenidos con una preparación comparable; el uso exitoso en un formato de muestra no establece la idoneidad para cualquier otro formato.

5. Elija el clon y el formato de producción para su experimento

Una preparación monoclonal deriva de un único clon de anticuerpo; las preparaciones policlonales contienen anticuerpos contra múltiples epítopos. Los policlonales pueden proporcionar una detección útil de múltiples epítopos, pero las preparaciones derivadas de animales pueden variar entre lotes. Ni la monoclonalidad ni una señal fuerte garantizan la ausencia de unión fuera de la diana. [4]

Recombinante describe la producción a partir de secuencias codificantes de anticuerpos, no una categoría de clonalidad separada. Los reactivos recombinantes definidos por secuencia respaldan la renovación y la ingeniería de un anticuerpo definido, pero aún requieren una caracterización específica del ensayo. Considere el clon exacto y el formato conjugado, la continuidad del suministro y la evidencia de consistencia entre lotes. [6]

Comprobación de selección: priorice los datos de rendimiento relevantes sobre una preferencia general por productos monoclonales, policlonales o recombinantes.

6. Seleccione el formato de detección como parte del ensayo completo

Para la detección indirecta, confirme que el anticuerpo secundario reconoce la especie hospedadora y la clase/subclase de inmunoglobulina del primario según sea necesario. En la tinción múltiplex, compruebe la reactividad cruzada entre los reactivos de detección y los otros primarios, utilizando controles de omisión diseñados adecuadamente. [3] Si marca el primario usted mismo, verifique que su formulación sea compatible con la química de conjugación elegida. [4]

En citometría de flujo, elija la combinación de clon y fluoróforo teniendo en cuenta el instrumento, la expresión del antígeno y otros marcadores del panel. El solapamiento espectral y la dispersión afectan a la resolución; el brillo por sí solo no es una regla de selección suficiente. Confirme la compatibilidad con la fijación/permeabilización. Utilice controles de tinción única adecuados para la compensación o la separación espectral, y controles FMO cuando sean útiles para la colocación de las puertas (gates). [8]

Comprobación de selección: la evidencia para un anticuerpo no conjugado no reemplaza la evaluación del conjugado en el panel final.

7. Planifique la validación complementaria, los controles y la titulación

El marco de cinco pilares fue propuesto por Uhlén et al. y posteriormente adaptado por Edfors et al. para Western blot. Estas son opciones complementarias, no cinco pruebas obligatorias para cada anticuerpo. Seleccione estrategias viables que respondan a la pregunta de especificidad relevante en su ensayo. [1] [2] [10]

• Estrategias genéticas: compare la señal tras la desactivación (knockout) o la interferencia (knockdown) de la diana. Límite: el agotamiento incompleto, las isoformas residuales o los efectos biológicos de la alteración génica pueden complicar la interpretación.
• Estrategias ortogonales: compare la lectura del anticuerpo con una medición independiente del anticuerpo en muestras adecuadas. Límite: la correlación por sí sola puede ser engañosa; la abundancia de ARNm no es intercambiable con la abundancia de proteínas.
• Anticuerpos independientes: compare anticuerpos que reconozcan epítopos diferentes y que no se solapen. Límite: la concordancia no es concluyente si los reactivos comparten reactividad fuera de la diana o tienen epítopos mal caracterizados.
• Estrategias de proteína etiquetada / expresión recombinante: evalúe el reconocimiento de una diana expresada identificada de forma independiente. Límite: las etiquetas (tags) y la sobreexpresión pueden alterar la abundancia, la localización o la accesibilidad del epítopo y pueden no representar la proteína endógena.
• Inmunocaptura seguida de espectrometría de masas: identifique las proteínas enriquecidas por el anticuerpo. Límite: las proteínas asociadas pueden co-purificarse; el rendimiento de la captura no establece la especificidad en tejido fijado o en un blot.

La adaptación de Western blot de Edfors incluye el análisis de captura-MS basado en geles de proteínas que migran en la posición detectada. Esto no debe confundirse con la inmunoprecipitación-MS, y la comigración o la sensibilidad limitada de la MS pueden restringir la interpretación. La validación sigue siendo específica de la aplicación y del contexto. [1] [2] [10]

Incluya muestras positivas y negativas para la diana. Para el Western blot, la masa de banda esperada por sí sola no es prueba de especificidad; las bandas adicionales pueden reflejar isoformas, procesamiento o modificaciones. [7] Para IHC/IF, los controles sin anticuerpo primario prueban el fondo de la detección/secundaria, no la especificidad del primario omitido. [3] Para la citometría de flujo, los controles FMO respaldan la colocación de las puertas, pero no establecen la especificidad de la diana. [8]

Titule el reactivo en muestras representativas en lugar de tratar la dilución de la ficha técnica como universal. Optimice una separación útil con un fondo aceptable, no simplemente la señal más fuerte. Registre el proveedor, el número de catálogo, el clon, el lote, el conjugado, el RRID cuando esté disponible y el protocolo final; vuelva a evaluar tras cambios relevantes en los reactivos o protocolos. [9] [7]

Comprobación de selección: defina tanto la evidencia que una estrategia de validación puede proporcionar como la incertidumbre que deja sin resolver.