Western blot protocol

El objetivo biológico del Western blot es confirmar la presencia, el tamaño y la abundancia relativa de proteínas en muestras complejas, con aplicaciones que van desde la investigación básica hasta el diagnóstico clínico. El uso de reactivos de alta calidad (tampones de lisis puros, anticuerpos validados, sustratos sensibles) mejora la especificidad y reduce el fondo, lo que da lugar a resultados más fiables. Por ejemplo, Sun et al. utilizaron tampón RIPA con inhibidores de proteasas y un sustrato ECL para la detección quimioluminiscente de proteínas virales. De hecho, el Western blot es uno de los métodos más utilizados en proteómica y biología celular, y sigue siendo esencial para validar biomarcadores y estudiar vías de señalización. Los reactivos de laboratorio de alta gama para inmunotransferencia (como RIPA de grado farmacéutico, anticuerpos de precisión y kits de detección optimizados) garantizan la reproducibilidad y la sensibilidad. Siguiendo un protocolo de Western blot estandarizado y utilizando reactivos de primera calidad, los investigadores obtienen patrones de bandas claros con una alta relación señal-ruido, lo que permite un análisis fiable de las proteínas en aplicaciones de investigación y diagnóstico.

Protocolo paso a paso

1- Preparación de la muestra

Antes de realizar un western blot, es necesario asegurarse de que la proteína de interés está disponible para la unión del anticuerpo. Para ello, normalmente es necesario preparar un lisado para liberar la proteína de las células o los tejidos. El lisado se puede dividir en varias alícuotas mezcladas con un tampón de carga y almacenarse a -80 °C hasta que se necesite.

- Disuelva las células o tejidos utilizando tampón RIPA suplementado con inhibidores de proteasa y fosfatasa.

- Sonique o agite las muestras para garantizar una lisis completa.

- Centrifugar a 16 000 g durante 20 minutos a 4 °C para eliminar los residuos.

- Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y mida la concentración de proteínas utilizando el ensayo BCA o Bradford .

2- Electroforesis SDS-PAGE

El gel se sumerge en un tampón, se cargan las muestras de proteínas y se aplica una corriente eléctrica al gel, lo que hace que las proteínas migren de un extremo del gel (electrodo negativo) al otro (electrodo positivo). Las proteínas se separan por tamaño; las proteínas más pequeñas se desplazan más rápidamente a través del gel, por lo que aparecen más abajo. Para confirmar el tamaño de cada proteína de la muestra, se analizan junto con escaleras de peso molecular.

- Prepare un gel de resolución de poliacrilamida al 10-15 % y un gel de apilamiento al 4 %.

- Mezcle 20 μg de muestra de proteína con tampón Laemmli.

- Hervir durante 5 minutos a 95 °C y, a continuación, centrifugar los tubos.

- Cargue un volumen igual de proteínas en los pocillos del gel SDS-PAGE (el porcentaje de acrilamida depende del tamaño de la proteína objetivo), sin olvidar un pocillo para las escaleras de peso de control.

- Migración a amperaje constante con búfer adecuado.

3- Transferencia de proteínas del gel a la membrana

Una vez completada la electroforesis, las proteínas se transfieren (o «se transfieren») a una membrana para su posterior incubación con anticuerpos. La membrana puede estar hecha de nitrocelulosa o fluoruro de polivinilideno (PVDF), ambas opciones adecuadas. Al igual que en la electroforesis, el proceso de transferencia utiliza una carga eléctrica para facilitar la migración de las proteínas. Las proteínas se desplazan desde el gel hacia el electrodo positivo, donde se adhieren a la membrana.

- Corte la membrana para que coincida con el tamaño del gel y active las membranas de PVDF con metanol (no es necesario para la nitrocelulosa).

- Montar el sándwich de transferencia:

- Realizar la transferencia utilizando:

• Transferencia húmeda: 100 V durante 60-90 minutos a 4 °C.
• Transferencia semiseca: 20 V durante 30-60 min.
• Transferencia en seco: Siga las instrucciones del fabricante.

Antes de continuar, puede comprobar que la proteína se ha transferido correctamente a la membrana. Puede comprobar el éxito de la transferencia utilizando azul de Coomassie (sumerja la membrana en tinción azul de Coomassie durante 5-10 minutos) y Ponceau S (incube brevemente la membrana en solución de Ponceau S durante 1-2 minutos) para teñir el gel. Enjuague la membrana e incúbela en solución de bloqueo. Puede utilizar la escalera de pesos moleculares preteñida como comprobación inicial para comparar la cantidad de proteína en el gel PAGE y en la membrana.

4- Incubación y revelación de anticuerpos

- Incubar la membrana en 5 % BSA en TBST durante 1 hora a temperatura ambiente.

- Incubar con el anticuerpo primario (diluido en tampón de bloqueo) durante toda la noche a 4 °C con agitación suave.

- Lave la membrana entre 3 y 5 veces con TBST (5 minutos por lavado).

- Incubar con anticuerpo secundario durante 1 hora a temperatura ambiente.

- Lave la membrana de nuevo entre 3 y 5 veces con TBST.

- Aplique el sustrato a la mancha.

Las manchas se pueden visualizar inmediatamente mientras aún están húmedas o, alternativamente, se pueden secar antes de visualizarlas. Coloque cada mancha en una funda protectora o sobre una superficie limpia antes de visualizarla para evitar la contaminación.