Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) è una forma specializzata di cromatografia liquida ampiamente utilizzata per l'analisi e la purificazione di proteine e altre macromolecole biologiche. Sviluppata originariamente da Pharmacia nel 1982, la FPLC è stata progettata come una tecnica cromatografica a media pressione ottimizzata per le biomolecole, in particolare le proteine, sensibili a condizioni estreme come alta pressione, pH estremo e solventi organici.
Principi e Meccanismo
La FPLC separa i componenti di una miscela in base alle loro diverse affinità tra una fase mobile e una fase stazionaria. La fase mobile nella FPLC è una soluzione tampone acquosa, la cui velocità di flusso è controllata con precisione da una pompa a spostamento positivo, tipicamente mantenuta a 1–5 mL/min sotto bassa pressione (inferiore a 5 bar). La fase stazionaria è costituita da perle di resina porosa, spesso agarosio reticolato, confezionate in colonne. Queste perle variano per dimensione e chimica superficiale a seconda del tipo di separazione richiesta.
Applicazioni
- Purificazione di proteine ricombinanti, anticorpi ed enzimi.
- Isolamento di acidi nucleici come oligonucleotidi e plasmidi.
- Preparazione di proteine per studi strutturali e funzionali.
- Rimozione di contaminanti come endotossine dalle preparazioni proteiche.
Vantaggi
- Condizioni operative delicate: bassa pressione e tamponi acquosi prevengono la denaturazione delle proteine.
- Alta risoluzione e riproducibilità: le piccole dimensioni delle perle e il controllo preciso del flusso migliorano la qualità della separazione.
- Automazione: facilita l’eluizione a gradiente, la gestione dei campioni e la raccolta delle frazioni.
- Scalabilità: adatta dalla scala analitica a quella preparativa o industriale.
- Versatilità: compatibile con molteplici modalità cromatografiche e tipi di campioni biologici.
La FPLC rappresenta una tecnica fondamentale nella biochimica delle proteine e nella biologia molecolare, offrendo una piattaforma robusta, delicata e versatile per la purificazione e l’analisi delle proteine. Il suo sviluppo ha notevolmente facilitato la produzione di proteine ad alta purezza, essenziali per la ricerca, la diagnostica e le applicazioni terapeutiche.
