Hot-start NeoTaq II DNA polymerase
Cat# NB-60-0008
Size : 500U
Marca : Neo Biotech
Datasheet (EN)
DNA polimerasi NeoTaq II con avvio a caldo
Descrizione
- La DNA polimerasi Hot-start NeoTaq II è una DNA polimerase ingegnerizzata con attività PCR simile all'hot-start.
- L'attività limitata a temperatura ambiente aiuta a prevenire l'estensione non specifica dei primer e la formazione di dimeri di primer.
- Offre maggiore specificità, sensibilità e resa di DNA nella PCR.
- Attivata in 5 minuti a 95°C per un rapido avvio della reazione.
- Supporta l'amplificazione di modelli di DNA fino a 6 kb con tempi di estensione rapidi di 15–30 s/kb.
- Richiede una minima ottimizzazione della PCR e consente la preparazione della reazione a temperatura ambiente.
- La DNA polimerasi Hot-start NeoTaq II è priva di attività esonucleasica 3′→5′ (correzione di bozze).
- Genera prodotti PCR con estensioni A in 3′, adatti per la clonazione TA con kit di clonazione PCR.
Condizioni di conservazione e preparazione dei reagenti
Questo prodotto deve essere conservato a una temperatura compresa tra -85 °C e -15 °C in un congelatore senza cicli di sbrinamento per garantire la massima durata di conservazione. Il prodotto rimarrà stabile fino alla data di scadenza se conservato come specificato.
Saggio di controllo qualità
Purezza
La purezza della DNA polimerasi Hot-start NeoTaq II è > 90% valutata mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide in SDS seguita da colorazione con Blu di Coomassie.
Contaminazione da DNA genomico
Il prodotto deve rispettare gli standard interni di contaminazione da DNA valutati tramite qPCR in tempo reale.
Saggi di nucleasi
0,2-0,3 μg di DNA plasmidico vengono incubati con 5 U di DNA polimerasi Hot-start NeoTaq II, in Tampone di Reazione 1×, per 14-16 ore a 37 °C. Dopo l'incubazione, il DNA viene visualizzato su un gel di agarosio colorato con colorante Safe DNA Gel Stain. Non devono essere presenti tagli o nick visibili sull'acido nucleico. Test simili vengono eseguiti con il tampone Hot-start NeoTaq II e la soluzione di MgCl2.
Saggio funzionale
La DNA polimerasi Hot-start NeoTaq II è ampiamente testata per le prestazioni in una reazione a catena della polimerasi (PCR) di frammenti di DNA di diverse dimensioni (1 e 2,5 kb) da DNA genomico umano. I prodotti PCR risultanti vengono visualizzati come singole bande in un gel di agarosio colorato con Safe DNA Gel Stain. Test funzionali simili vengono eseguiti con il tampone Hot-start NeoTaq II e la soluzione di MgCl2.
Risoluzione dei problemi
Nessuna amplificazione del prodotto o bassa resa
• Temperatura di appaiamento inadeguata
La composizione della miscela di reazione può influenzare le proprietà di fusione dei primer e del DNA. Regolare la temperatura di appaiamento per adattarla al primer con la temperatura di fusione più bassa (da 5 °C a 10 °C inferiore alla Tm).
• Presenza di inibitori della PCR
Alcune procedure di isolamento del DNA, in particolare l'isolamento del DNA genomico, possono comportare la co-purificazione di inibitori della PCR. Ridurre il volume del DNA stampo nella reazione o diluire il DNA stampo prima di aggiungerlo alla reazione. È stato dimostrato che la diluizione dei campioni anche di 1:10.000 è efficace per migliorare i risultati, a seconda della concentrazione iniziale di DNA.
• Additivi necessari
L'aggiunta di agenti potenzianti la PCR (Soluzione Optimizer 5× o Soluzione GC-Enhancer 2×) può migliorare la resa consentendo al contempo l'amplificazione di stampi difficili.
Presenza di bande non specifiche
• Appaiamento non specifico dei primer
Regolare le condizioni di appaiamento e/o progettare un altro set di primer, aumentandone la lunghezza ed evitando sequenze complementari.
• Concentrazione di Mg2+ troppo alta
Generalmente, 1,5-3 mM di MgCl2, tipicamente una concentrazione finale di 2,5 mM, funziona bene per la maggior parte delle reazioni PCR. La concentrazione ottimale dipende dallo stampo bersaglio, dal tampone e dai dNTP. Ottimizzare la concentrazione di magnesio integrando MgCl2 con incrementi di 0,5 fino a 4 mM.