Fosfofruttochinasi-1 (PFK-1) è un enzima regolatore cruciale nella glicolisi, la base sia della respirazione anaerobica che aerobica. In quanto enzima che controlla la velocità, la sua attività determina la rapidità della glicolisi. PFK-1 catalizza il passaggio "impegnato" della glicolisi, ovvero la conversione di fruttosio 6-fosfato e ATP in fruttosio 1,6-bisfosfato e ADP. Questo enzima è allosterico, composto da quattro subunità, ed è regolato da vari attivatori e inibitori.
Funzione e Regolazione
PFK regola la glicolisi tramite inibizione allosterica, permettendo alla cellula di adeguare la velocità della glicolisi alle sue necessità energetiche. Per esempio, un alto rapporto ATP/ADP inibisce la PFK e, di conseguenza, la glicolisi. Negli eucarioti, la PFK è attivata dal fruttosio 2,6-bisfosfato, che supera l'inibizione da ATP, fornendo agli eucarioti una maggiore sensibilità a ormoni come glucagone e insulina.
PFK-1 appartiene alla famiglia delle fosfotransferasi e facilita il trasferimento del gruppo γ-fosfato dall'ATP al fruttosio-6-fosfato. Il sito attivo di PFK-1 include sia il sito di legame ATP-Mg2+ che quello F6P. Attivatori allosterici come AMP e ADP si legano al sito allosterico per promuovere la formazione dello stato R inducendo cambiamenti strutturali, mentre inibitori come ATP e PEP si legano allo stesso sito per favorire la formazione dello stato T, inibendo così l'attività enzimatica.
Kit per il Saggio della Fosfofruttochinasi
I kit per il saggio della fosfofruttochinasi offrono un metodo semplice e diretto per misurare l'attività della PFK in diversi campioni. Questi kit sfruttano il ruolo della PFK nella conversione del fruttosio-6-fosfato in fruttosio-1,6-difosfato, che è il passaggio limitante della glicolisi. L'attività della PFK è regolata da cofattori e modifiche post-traduzionali e può essere utilizzata per misurare il flusso glicolitico nei tessuti. Le carenze nell'attività della PFK possono portare a malattie da accumulo di glicogeno come la glicogenosi di tipo VII (malattia di Tarui).
Principio del Saggio
L'attività della PFK viene misurata tramite un saggio enzimatico accoppiato. In questo saggio, la PFK converte fruttosio-6-fosfato e ATP in fruttosio-1,6-difosfato e ADP. Successivamente, la miscela enzimatica converte l'ADP in AMP e NADH. Il NADH risultante riduce una sonda incolore, producendo un prodotto colorimetrico proporzionale all'attività della PFK.