Gli anticorpi primari anti-cavallo coniugati con HRP sono immunoreagenti marcati con enzimi per la rilevazione cromogenica, chemioluminescente e chemioluminescente avanzata (ECL) di antigeni equini. Prodotti immunizzando ospiti come capre, conigli o topi con immunoglobuline equine purificate, gli anticorpi sono purificati per affinità e coniugati covalentemente con perossidasi di rafano (HRP, MW ≈ 40 kDa), una glicoproteina di origine vegetale con gruppi protesici eme essenziali per l'attività catalitica. La coniugazione viene tipicamente ottenuta tramite ossidazione con periodato, ossidando i residui di carboidrati sull'enzima in aldeidi che reagiscono con le ammine primarie sull'anticorpo, producendo stabili legami a base di Schiff. Il coniugato risultante mantiene un rapporto molare enzima-proteina (E/P) di circa 3–5, ottimizzando l'efficienza catalitica e preservando al contempo l'affinità di legame con l'antigene. L'HRP catalizza l'ossidazione di vari substrati in presenza di perossido di idrogeno: il TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina) produce un prodotto colorimetrico blu misurabile a 450 nm; il DAB (3,3'-diaminobenzidina) genera un precipitato marrone adatto per l'immunoistochimica; e i substrati a base di luminol generano un'emissione chemioluminescente rilevabile tramite pellicola a raggi X o sistemi di imaging digitale. Le specificità disponibili includono reagenti anti-IgG (H+L), anti-IgG (Fc), sottoclassi di anti-IgG (IgG1, IgG2, IgG3) e anti-IgM. I prodotti sono tipicamente forniti in soluzione fisiologica tamponata con fosfato con proteine stabilizzanti come BSA o gelatina e contengono il 40–50% di glicerolo per prevenire il congelamento a –20°C. L'ampia cromo-adsorbimento incrociato contro immunoglobuline bovine, ovine, caprine, di coniglio e di topo elimina il legame aspecifico in campioni multi-specie.

Applicazioni

I coniugati HRP sono ampiamente impiegati in molteplici formati di dosaggio immunologico per la rilevazione di antigeni equini. Nel Western blotting, questi anticorpi consentono una sensibile rilevazione chemioluminescente di proteine equine separate mediante SDS-PAGE, con diluizioni tipiche che vanno da 1:1.000 a 1:50.000 a seconda dell'abbondanza dell'antigene e della sensibilità del substrato. Nell'ELISA, i coniugati HRP fungono da anticorpi di rilevazione per la quantificazione di titoli anticorpali equini, livelli di citochine o concentrazioni di antigeni in siero, plasma e altri fluidi biologici; substrati cromogeni TMB o chemioluminescenti forniscono letture sensibili sia in configurazione diretta che a sandwich. Nell'immunoistochimica e nell'immunocitochimica, la deposizione mediata da HRP di DAB o AEC (3-ammino-9-etilcarbazolo) produce precipitati permanenti nei siti antigenici in tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina, sezioni congelate o cellule colturate, consentendo l'analisi morfologica mediante microscopia ottica. Nelle applicazioni di dot blot e array proteici, questi coniugati forniscono una rilevazione robusta per lo screening simultaneo di più campioni. Ulteriori applicazioni includono il dosaggio immunoenzimatico (EIA), i microarray tissutali e l'ibridazione in situ.

Tuttavia, l'attività dell'HRP è inibita dall'azide sodica (comunemente utilizzata come conservante), richiedendo tamponi privi di azide per prestazioni ottimali. Le diluizioni di lavoro tipiche dipendono dall'applicazione: 1:1.000–1:20.000 per il Western blotting (chemioluminescente), 1:1.000–1:100.000 per l'ELISA e 1:200–1:5.000 per l'immunoistochimica. Questi reagenti sono destinati esclusivamente a scopi di ricerca e non a procedure diagnostiche.