2. Differenziazione del trofoblasto

La differenziazione del trofoblasto è governata da programmi coordinati di segnalazione, trascrizionali ed epigenetici che regolano il mantenimento dei progenitori del citotrofoblasto (CTB) e l'impegno verso gli stati di sinciziotrofoblasto (STB) e trofoblasto extravilloso (EVT). Questi meccanismi sono stati investigati utilizzando sistemi complementari di cellule staminali del trofoblasto umane e di topo, modelli di differenziazione di cellule staminali pluripotenti umane, colture primarie di trofoblasto, organoidi ed embrioni di topo geneticamente manipolati. Sebbene diverse vie regolatorie siano condivise, la specificazione e la differenziazione del lineage del trofoblasto non sono completamente conservate tra le specie; in particolare, il lineage EVT umano non ha un equivalente diretto uno-a-uno nel topo.

Specificazione trascrizionale e l'asse Hippo/TEAD4

Nel conceptus di topo, l'attività differenziale della via Hippo collega la posizione cellulare e il contatto intercellulare alla specificazione del trofoblasto. La fosforilazione mediata da LATS restringe il YAP nucleare nelle cellule interne, mentre l'attività ridotta della via Hippo consente l'interazione nucleare di YAP con TEAD4 nelle cellule esterne. L'attività di TEAD4 è quindi associata alla specificazione del trophectoderma e all'attivazione di programmi trascrizionali associati al trofoblasto, inclusa Cdx2. GATA3 agisce all'interno della rete regolatoria associata a TEAD4 e contribuisce, insieme a CDX2, alla specificazione e differenziazione del trofoblasto nel topo. La rete trascrizionale centrata su ELF5 fornisce un ulteriore livello di regolazione delle cellule staminali del trofoblasto. I cambiamenti nell'abbondanza di ELF5 influenzano le sue interazioni con i regolatori trascrizionali inclusi EOMES e TFAP2C e modificano l'equilibrio tra i programmi trascrizionali associati all'autorinnovamento e alla differenziazione.

Nei modelli di trofoblasto umano, le relazioni regolatorie tra TEAD4, CDX2, GATA3 e altri regolatori di lineage sono più complesse e non devono essere assumute come una riproduzione diretta della gerarchia del topo.

Segnalazione BMP e impegno del trofoblasto umano

BMP4 è ampiamente utilizzato sperimentalmente per indurre la differenziazione associata al trofoblasto a partire da cellule staminali pluripotenti umane. L'esposizione a BMP4 attiva programmi trascrizionali associati al trofoblasto mentre sopprime stati associati alla pluripotenza in diversi sistemi sperimentali. Studi di differenziazione diretta da BMP4 hanno identificato un intermedio simile al citotrofoblasto positivo per ΔNp63 in alcuni modelli di cellule staminali pluripotenti umane prima della successiva differenziazione del trofoblasto. Una rete trascrizionale GATA2/3–TFAP2A/C è stata anche associata all'acquisizione e al mantenimento dell'identità del trofoblasto, mentre GATA3 contribuisce all'impegno del trofoblasto in sistemi di differenziazione basati su BMP4.

Le risposte a BMP4 sono fortemente influenzate dalla modulazione simultanea di vie concorrenti. I protocolli di differenziazione di cellule staminali pluripotenti umane hanno quindi incorporato l'inibizione della segnalazione di Activin/Nodal/TGF-β e FGF per orientare la differenziazione verso stati associati al trofoblasto. Queste condizioni sono sperimentali e dipendenti dal sistema e non devono essere interpretate come una rappresentazione universale della specificazione o differenziazione fisiologica del trofoblasto umano.

Segnalazione Wnt/β-catenina e differenziazione del trofoblasto

La segnalazione canonica Wnt/β-catenina contribuisce alla regolazione e differenziazione delle cellule staminali del trofoblasto, ma i suoi effetti sono altamente dipendenti dallo stato cellulare, dal contesto di sviluppo e dalle condizioni sperimentali. La manipolazione sperimentale della segnalazione Wnt nei modelli di trofoblasto umano può modificare la proliferazione, la differenziazione, la migrazione, l'invasione e l'espressione di geni associati al lineage. Queste osservazioni supportano un ruolo della trascrizione dipendente da Wnt nella differenziazione del trofoblasto e nei fenotipi invasivi, ma non stabiliscono l'attivazione di Wnt come un determinante unico o universale della specificazione dell'EVT.

La segnalazione Wnt deve quindi essere considerata in congiunzione con altri meccanismi regolatori di lineage che controllano l'adesione cellulare, la migrazione, le interazioni con la matrice extracellulare e lo stato di differenziazione del trofoblasto, piuttosto che come un driver isolato dello sviluppo dell'EVT.

Segnalazione Notch e TGF-β/SMAD

La segnalazione Notch ha un ruolo stabilito sperimentalmente nello sviluppo del lineage del trofoblasto umano. NOTCH1 è associato allo sviluppo dell'EVT, e la manipolazione sperimentale della segnalazione di NOTCH1 altera la differenziazione verso il lineage extravilloso. NOTCH2 mostra pattern di espressione distinti tra i sottotipi di CTB del primo trimestre, coerenti con una regolazione dinamica della segnalazione della famiglia Notch attraverso le popolazioni di trofoblasto e gli stati di differenziazione, sebbene le differenze di espressione non debbano essere interpretate da sole come evidenza di un ruolo funzionale specifico.

La segnalazione TGF-β è similmente dipendente dal sottotipo di trofoblasto e dallo stato di sviluppo. Analisi sperimentali della fosforilazione, localizzazione ed espressione di SMAD2/3 dimostrano un'attivazione differenziale della segnalazione canonica TGF-β attraverso le popolazioni di trofoblasto del primo trimestre. Questi risultati supportano un ruolo dipendente dal contesto della segnalazione TGF-β/SMAD nella differenziazione del trofoblasto piuttosto che un effetto uniforme su tutte le popolazioni di trofoblasto.

Segnalazione di ipossia/HIF e differenziazione dell'EVT

La disponibilità di ossigeno rappresenta un regolatore ambientale sperimentalmente manipolabile della differenziazione del trofoblasto. La tensione di ossigeno ridotta può dirigere CTB umani primari verso un fenotipo associato all'EVT, e questa risposta dipende, almeno in parte, dalla segnalazione del fattore inducibile dall'ipossia. I cambiamenti associati all'ipossia includono alterazioni nella morfologia cellulare, nell'adesione e nei programmi di differenziazione, collegando l'asse ipossia/HIF/trofoblasto all'acquisizione di caratteristiche associate all'EVT. Queste osservazioni indicano che la segnalazione dipendente dall'ossigeno può modulare la differenziazione del trofoblasto, mentre la risposta precisa rimane dipendente dalla concentrazione di ossigeno, dallo stato di sviluppo e dal modello sperimentale.

Coltura di cellule staminali del trofoblasto e differenziazione diretta

Le cellule staminali del trofoblasto umane forniscono un sistema sperimentale per investigare l'autorinnovamento e la differenziazione del lineage del trofoblasto. I sistemi di coltura di TSC umane stabiliti incorporano la segnalazione del fattore di crescita epidermico, l'attivazione canonica di Wnt, l'inibizione di vie che promuovono la differenziazione e l'inibizione di ROCK durante procedure di coltura appropriate. Nel sistema di TSC umane stabilito, la modulazione aggiuntiva dello stato epigenetico, inclusa l'inibizione dell'istone deacetilasi, contribuisce al mantenimento dello stato di cellule staminali del trofoblasto.

La manipolazione sperimentale di vie può coinvolgere CHIR99021 per stimolare la segnalazione canonica Wnt, A83-01 o inibitori correlati per sopprimere la segnalazione di Activin/TGF-β, EGF per supportare la propagazione di cellule staminali del trofoblasto e Y-27632 per inibire lo stress cellulare dipendente da ROCK durante procedure selezionate. I sistemi di differenziazione basati su BMP4 possono ulteriormente utilizzare inibitori di vie come A83-01 e, in contesti sperimentali specifici, PD173074 per modulare segnali concorrenti di TGF-β e FGF. Questi reagenti rappresentano componenti di sistemi sperimentali distinti e non devono essere interpretati come una singola formulazione standardizzata di differenziazione del trofoblasto.

L'elevazione mediata da forskolina del cAMP intracellulare è utilizzata sperimentalmente per promuovere la sincizializzazione del trofoblasto e i fenotipi associati allo STB. In questi sistemi, la fusione cellulare è accompagnata da cambiamenti trascrizionali e morfologici associati alla differenziazione del sinciziotrofoblasto.

Le TSC di topo forniscono un modello genetico complementare in cui regolatori come TEAD4, GATA3, ELF5, EOMES e TFAP2C possono essere manipolati direttamente per investigare lo stemness del trofoblasto, la specificazione del lineage e la differenziazione. I risultati di questo modello rimangono essenziali per definire meccanismi trascrizionali causali, ma devono essere interpretati nel contesto delle differenze specie-specifiche nello sviluppo del trofoblasto.

Organoidi di trofoblasto tridimensionali

Gli organoidi di trofoblasto umani tridimensionali forniscono un modello in cui le popolazioni progenitrici di CTB possono essere mantenute e differenziate all'interno di un ambiente multicellulare organizzato. I sistemi di organoidi di trofoblasto umani riproducono caratteristiche importanti dello sviluppo precoce del trofoblasto placentare e possono generare popolazioni di trofoblasto differenziate rilevanti per la biologia dello STB e, in condizioni sperimentali appropriate, dell'EVT.

I sistemi di coltura di organoidi definiti possono incorporare EGF, modulazione della via canonica Wnt, inibizione della via TGF-β e componenti aggiuntivi di fattori di crescita o matrice extracellulare per supportare l'autorinnovamento e la differenziazione del trofoblasto. Le matrici di matrice extracellulare forniscono supporto strutturale per la formazione di organoidi tridimensionali e l'organizzazione epiteliale. Tuttavia, la composizione della matrice e la disponibilità di fattori di crescita possono influenzare lo stato cellulare e la differenziazione, rendendo la composizione della matrice extracellulare una variabile sperimentale importante.

Analisi a cellula singola e risoluzione del lineage

Il sequenziamento di RNA a cellula singola fornisce un'analisi ad alta risoluzione dell'eterogeneità del trofoblasto che non è ottenibile da misurazioni trascrittomiche bulk. Approcci trascrittomici a cellula singola e di inferenza di traiettorie hanno identificato stati di trofoblasto trascrittomically distinti e hanno consentito l'inferenza di relazioni di sviluppo tra CTB progenitori, CTB in differenziazione, popolazioni associate allo STB e popolazioni associate all'EVT. Questi approcci facilitano anche il confronto del tessuto placentare primario con modelli di cellule staminali del trofoblasto e organoidi.

L'inferenza di traiettorie e le analisi pseudotemporali devono tuttavia essere interpretate come modelli computazionali di relazioni di sviluppo piuttosto che come prova sperimentale diretta di transizioni di lineage. Analisi complementari di tracciamento del lineage, perturbazione, funzionali e temporali sono richieste per stabilire relazioni causali di lineage.

Nel topo, la manipolazione genetica del lineage e gli approcci di loss- o gain-of-function forniscono evidenza complementare per relazioni causali tra l'attività di fattori di trascrizione e il destino del trofoblasto. La manipolazione sperimentale di Tead4, Gata3 e Elf5, insieme ad analisi di differenziazione di cellule staminali e di embrioni, è stata utilizzata per distinguere regolatori richiesti per l'identità del trofoblasto da fattori associati secondariamente alla differenziazione.

Validazione molecolare e cellulare

La validazione della differenziazione del trofoblasto richiede generalmente misurazioni molecolari, cellulari e funzionali concordanti. KRT7/CK7 è ampiamente utilizzato come marcatore associato al trofoblasto, sebbene non sia unicamente specifico per i trofoblasti. L'espressione associata a CGB/hCG è frequentemente valutata durante la differenziazione dello STB e riflette programmi endocrini del trofoblasto e associati alla sincizializzazione piuttosto che costituire un marcatore definitivo indipendente dell'identità dello STB. HLA-G è comunemente utilizzato per identificare popolazioni associate all'EVT, in particolare EVT differenziato/invasivo, ma deve altrettanto essere interpretato insieme a marcatori di lineage aggiuntivi e proprietà funzionali.

Immunofluorescenza, immunoistochimica, citometria a flusso, RT-PCR quantitativa, western blotting e profiling trascrittomico forniscono approcci complementari per definire fenotipi associati al lineage. Analisi funzionali possono ulteriormente valutare la fusione cellulare, la migrazione, l'invasione, l'adesione e le interazioni con la matrice extracellulare, consentendo di interpretare l'espressione di marcatori molecolari insieme al fenotipo cellulare.

Per lo STB, la formazione di sincizio e i cambiamenti molecolari associati alla fusione sono particolarmente informativi, mentre gli studi sull'EVT incorporano comunemente saggi di migrazione e invasione insieme all'espressione di HLA-G e marcatori aggiuntivi associati all'EVT. Combinare misurazioni molecolari, morfologiche e funzionali è quindi preferibile all'assegnazione dell'identità del trofoblasto sulla base di un singolo marcatore.

Visione integrata della differenziazione del trofoblasto

Collettivamente, gli studi sperimentali supportano un modello in cui i meccanismi di differenziazione del trofoblasto sorgono da una rete interattiva di segnalazione dipendente da Hippo/TEAD4, BMP, Wnt/β-catenina, Notch, TGF-β/SMAD e HIF insieme a fattori di trascrizione regolatori di lineage inclusi CDX2, GATA3, TEAD4, TFAP2C e ELF5. Il contributo relativo di ciascuna via dipende dalla specie, dallo stadio di sviluppo, dallo stato cellulare e dal contesto sperimentale. Le loro interazioni regolano il mantenimento delle cellule staminali del trofoblasto, l'impegno del lineage, la fusione del sinciziotrofoblasto e l'invasione del trofoblasto extravilloso, contribuendo ai programmi cellulari sottostanti allo sviluppo placentare precoce.