Master mix NeoTaq II
Descrizione
- NeoTaq II Master Mix: miscela pronta all'uso per una PCR standard robusta e affidabile.
- Contiene DNA polimerasi, dNTP, tampone di reazione e additivi ottimizzati.
- Supporta l'amplificazione di templati di DNA fino a 6 kb.
- MgCl₂ a 2,5 mM che consente protocolli di PCR flessibili.
- I coloranti di tracciamento blu e giallo consentono il caricamento diretto su gel di agarosio.
- Nessuna attività esonucleasica 3′→5′; produce estremità sporgenti A (A-overhangs) adatte per la clonazione TA.
- Per applicazioni successive basate sulla fluorescenza o sull'assorbanza, purificare prima i prodotti di PCR o utilizzare la versione senza colorante.
Condizioni di conservazione
Questa master mix deve essere conservata a una temperatura compresa tra -85 °C e -15 °C in un congelatore senza cicli di sbrinamento per garantire la massima durata di conservazione. L'elevata stabilità termica della miscela di enzimi le consente di rimanere stabile a 4 °C o persino a temperatura ambiente per un massimo di 4 settimane. Il prodotto rimarrà stabile fino alla data di scadenza se conservato come specificato.
Saggi di controllo qualità
Purezza
La purezza della DNA polimerasi NeoTaq II è >90% valutata mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di SDS seguita da colorazione con blu di Coomassie.
Contaminazione da DNA genomico
Il prodotto deve essere privo di qualsiasi contaminazione da DNA rilevabile, come valutato tramite PCR. Pertanto, è adatto per l'amplificazione del DNA batterico e fungino sulla base di saggi di PCR per RNA ribosomiale 16S e 18S.
Saggi di nucleasi
0,2-0,3 μg di DNA plasmidico vengono incubati con NeoTaq II Master mix per 14-16 ore a 37 °C. Dopo l'incubazione, il DNA viene visualizzato su qualsiasi gel di agarosio colorato con Safe DNA Gel Stain. Non devono essere presenti tagli o nick visibili sull'acido nucleico.
Saggio funzionale
NeoTaq II Master mix viene testato per le prestazioni in una reazione a catena della polimerasi (PCR) per l'amplificazione di frammenti di DNA di diverse dimensioni (1 e 2,5 kb) da DNA genomico umano. I prodotti di PCR risultanti vengono visualizzati come singole bande in qualsiasi gel di agarosio colorato con Safe DNA Gel Stain.
Risoluzione dei problemi
Nessuna amplificazione del prodotto o basso rendimento
Temperatura di annealing inadeguata
La composizione della miscela di reazione può influenzare le proprietà di fusione dei primer e del DNA. Regolare la temperatura di annealing per adattarla al primer con la temperatura di fusione più bassa (da 5 °C a 10 °C inferiore alla Tm).
Presenza di inibitori della PCR
Alcune procedure di isolamento del DNA, in particolare l'isolamento del DNA genomico, possono comportare la copurificazione di inibitori della PCR. Ridurre il volume del DNA stampo nella reazione o diluire il DNA stampo prima di aggiungerlo alla reazione. È stato dimostrato che la diluizione dei campioni fino a 1:10.000 è efficace per migliorare i risultati, a seconda della concentrazione iniziale di DNA.
La concentrazione di Mg2+ è troppo bassa
Il Mg2+ è incluso nella Master Mix a una concentrazione finale di 2,5 mM, che è sufficiente per la maggior parte dei target. Per alcuni target potrebbe essere necessaria una concentrazione di Mg2+ più elevata. Eseguire una titolazione da 2,5 mM a 4 mM (concentrazione finale) con incrementi di 0,5 mM. (Nota: il MgCl2 non viene fornito in provette separate).
Presenza di bande non specifiche
Annealing non specifico dei primer
Regolare le condizioni di annealing e/o progettare un altro set di primer, aumentando la lunghezza ed evitando sequenze complementari.