Les anticorps primaires anti-cheval conjugués au FITC (isothiocyanate de fluorescéine) sont des immunoréactifs fluorescents émettant dans le vert, conçus pour la détection d'antigènes équins dans les applications basées sur la fluorescence. Produits par immunisation d'animaux hôtes tels que la chèvre, le lapin ou la souris avec des immunoglobulines de cheval purifiées, ces anticorps sont purifiés par chromatographie d'immunoaffinité puis conjugués de manière covalente au FITC, un fluorophore largement utilisé présentant des maxima d'excitation et d'émission d'environ 495 nm et 519 nm, respectivement. Le groupement isothiocyanate réagit avec les fonctions amines primaires des résidus lysine pour former des liaisons thiourée stables. Le rapport fluorophore/protéine (F/P) est généralement compris entre 3 et 8, assurant un équilibre optimal entre l'intensité de fluorescence et la conservation de l'activité de liaison à l'antigène. Grâce à sa compatibilité avec les lasers à argon de 488 nm et les jeux de filtres FITC standard, le FITC demeure l'un des fluorophores les plus utilisés en immunofluorescence. Les formats disponibles comprennent des anticorps anti-IgG (H+L), anti-sous-classes d'IgG (par exemple IgG1, IgG2) ainsi que des anticorps anti-IgM. Une adsorption croisée approfondie contre les immunoglobulines de souris, rat, lapin et humain permet de réduire les liaisons non spécifiques.
Applications
Les anticorps primaires anti-cheval conjugués au FITC sont largement utilisés en cytométrie en flux et en tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour l'immunophénotypage des leucocytes équins et la détection de marqueurs de surface cellulaire tels que CD4, CD8, CD11a et les molécules du CMH de classe II. En microscopie d'immunofluorescence, ils permettent la visualisation et la localisation des antigènes cibles dans les coupes tissulaires et les cellules en culture grâce à leur fluorescence verte caractéristique. Ils sont également utilisés en ELISA avec des systèmes de détection anti-FITC ou par lecture directe de la fluorescence, ainsi qu'en microscopie à fluorescence, en microscopie confocale, en Western blot fluorescent et dans les immunodosages multiplex sur billes.
Performances et considérations expérimentales
Bien que le FITC soit apprécié pour sa polyvalence et sa large compatibilité avec les instruments de fluorescence, il est sensible au photoblanchiment et aux variations de pH, avec des performances optimales entre pH 7,0 et 9,0. Ces caractéristiques peuvent limiter son utilisation dans les expériences d'imagerie prolongées ou dans les applications réalisées en conditions acides. Les dilutions de travail recommandées sont généralement comprises entre 1:50 et 1:500 pour la cytométrie en flux, 1:100 et 1:1 000 pour la microscopie d'immunofluorescence et 1:1 000 et 1:5 000 pour les essais ELISA, selon le protocole expérimental et la préparation de l'anticorps. Ces réactifs sont exclusivement destinés à un usage en recherche (RUO – Research Use Only) et ne sont pas approuvés pour des applications diagnostiques ou thérapeutiques.