Clones d’ADNc humains représentent des molécules d’ADN recombinant contenant des séquences d’ADN complémentaire (ADNc) synthétisées à partir d’ARN messager (ARNm) humain, capturant les gènes codant pour des protéines sans introns, pour des études fonctionnelles et d’expression.
Définition et synthèse
Les clones d’ADNc sont issus de la transcription inverse d’ARNm poly(A)+ à l’aide de la transcriptase inverse, produisant un ADNc simple brin qui est ensuite étendu par l’ADN polymérase pour former des molécules double brin, puis ligaturé dans des vecteurs tels que plasmides ou phages lambda. Les librairies humaines issues de tissus (cerveau, foie) ou de lignées cellulaires fournissent des clones complets ou partiels, souvent incluant les régions 5’/3’ non traduites (UTR). Des collections telles que hORFeome ou CCSB-Broad regroupent plus de 30 000 ORFs humains vérifiés dans des vecteurs d’entrée compatibles Gateway.
Caractéristiques
Les clones présentent des cadres de lecture corrects (70 % dans les librairies de haute qualité), des étiquettes His pour la purification, des tailles comprises entre 0,5 et 10 kb correspondant aux protéines prédites (15–200 kDa), et des inserts vérifiés via le séquençage Sanger ou de nouvelle génération. Les clones complets privilégient les ORFs entiers, les variantes d’épissage capturent les isoformes, et le criblage de solubilité identifie les protéines exprimables dans E. coli (~25 % de succès).
Construction et criblage
Les librairies contiennent 105–106 clones disposés sur des membranes pour la détection immunologique des fusions His, suivie d’une expression et purification à petite échelle. Par exemple, 2 746 clones sur 10 825 issus de la librairie hEx1 ont produit des protéines solubles ≥15 kDa. Le transfert vers des vecteurs lentiviraux, baculoviraux ou mammifères (ex. pcDNA) permet la surexpression. La génomique structurale sélectionne des clones pour la cristallisation (par exemple, 17 sur 163 ont donné 3 structures).
Applications
Les clones d’ADNc humains facilitent la production protéique pour la cristallographie par rayons X et la RMN, les essais fonctionnels, les puces haut débit et les vecteurs de thérapie génique. Ils définissent les isoformes (ex. N-CAM 120/140/180 kDa via épissage) et soutiennent les études transcriptomiques.
