Protocole général

L'ADN Polymérase KAPA HiFi est un nouveau système enzymatique qui présente une fidélité et des performances supérieures en comparaison avec d'autres polymérases. KAPA HiFi a été conçu pour avoir une affinité accrue pour l'ADN résultant en des améliorations importantes du rendement, de la sensibilité, de la vitesse et de la capacité d'amplifier des modèles difficiles.

Apllications

Le KAPA HiFi PCR Kit est idéal pour les PCR haute-fidélité comme:

• L'amplification des longs fragments d'ADN pour le séquençage conventionnel (séquençage direct ou séquençage de produits PCR clonés)
• L'amplification de fragments courts riches en GC et AT pour le séquençage nouvelle génération (NGS)
• L'amplification de fragements d'ADN de plus de 15 kb pour l'ADN génomique ou 18 kb pour des cibles moins complexes (plasmide ou ADN lambda), pour le clonage et l'expression de protéines ou la caractérisation généomique
• L'introduction de mutations simples ou pultiples en utilisant la mutagenèse dirigée
  

1.Volumes de réaction

Composant	Concentration Finale	Pour 25 µl de réaction
Eau PCR		Ajuster à 25 µl
Amorce sens (10 μM)	0.3μM	0.75μl
Amorce anti-sens (10 μM)	0.3μM	0.75μl
5X KAPA HiFi Fidelity or GC Buffer (contient 2.0 mM Mg2+ à 1X)	1X	5.0 µl
KAPA dNTP Mix (10 mM de chaque)	0.3 mM de chaque	0.75 µl
DMSO (100%) (pour les amplicons avec un GC%supérieur à 70%)	5%	1.25 µl
Echantillon d'ADN	Volume nécessaire	10-100 ng pour l'ADN génomique 1-10 ng pour les ADN moins complexes
KAPA HiFi ADN Polymérase (1 µ/µl)	0.5 U/ 25 µl de réaction	0.50 µl

2. Paramètres des cycles

Etape du cycle	Temps et température	Cycles
Dénaturation initiale	2-5 min à 95ºC	1
Dénaturation	20 sec à 98ºC	15-35
Hybridation	15 sec à Th optimale (selon les amorces)
Extension	15-60 sec/kb à 72ºC
Extension finale	1-5 min/kb à 72ºC	1
Pause	4-10°C	1

3.  Produits
 

Désignation	Conditionnement	Référence
KAPA HiFi DNA polymerase	100 U	KK2101
	250 U	KK2102
KAPA HiFi HotStart DNA polymerase	100 U	KK2501
	250 U	KK2502
KAPA HiFi HotStart Readymix DNA polymerase	100 rxn	KK2601
	500 rxn	KK2602

4.Résultats

Amplification de la cible hgDNA jusqu'à 11 ko. Chaque cible a été amplifié à partir d'une gamme de concentrations du modèle hgDNA (50 ng à 0,5 ng par réaction). Les réactions (25 µl chacune) ont été réalisées en utilisant des profils de cycles en 3 étapes (35 cycles): 20 sec de dénaturation, 15 sec d'hybridation, et 30 sec/kb d'extension. Le temps de réaction total de l'amplicon de 11 kb était de 3h 50min. 12,5 ul de chaque réaction a été chargé sur le gel.