Protocole général de PCR pour le séquençage NGS
Protocole KAPA HiFi™ Library Amplification Kit
Protocole d'amplification de banque
Etape 1: Préparation
- Décongeler les amorces nécessaire à la PCR (voir Tableau 1 pour les détails) et le tube de KAPA HiFi HotStart Ready Mix (2X) à température ambiante.
- Centrifuger brièvement le KAPA HiFi HotStart Ready Mix (2X) décongelé et les tubes d'amorces 5 secondes à 600 x g.
- Décongeler et centriguger brièvement l'adaptateur ligaturé, bibliothèque ADN purifié séparé selon la taille pendant 5 secondes à 600 x g.
- Pré-programmer le thermocycleur en utilisant le protocole de cycle recommandé fourni dans le Tableau 1 pour les types spécifiques de bibliothèques Illumina.
Etape 2: Installation de la réaction
Afin de maintenir la diversité des banques optimale, il est nécessaire d'ajouter suffisamment d'adaptateur ligaturé à la banque d'ADN à chaque réaction d'enrichissement par PCR. Le nombre de cycles optimaux dépend du volume et de la concentration du matériel de banque ajouté à chaque 50 µl de réaction de PCR. Le dosage PCR peut être réalisé pour optimiser le rendement avant de procéder à l'enrichissement préparatif aux réactions de PCR/s.
Pour chaque réaction, ajouter les composés suivants en changeant de cônes après chaque étape de pipetage. Consulter le tableau 1 pour le montage réactionnel proposé pour la préparations de protocoles spécifiques de la banque.
- 25μL de KAPA HiFi HotStart Ready Mix (2X)
- Mélange d'amorces ou chaque amorce individuel
- Purified adaptor-ligated library DNA
- Ajuster à 50μL avec l'eau pour PCR
- Sceller chaque mélange réactionnel, mélanger légèrement et centrifuger pendant 5 secondes à 600 xg
Etape 3: Protocole du cycle
Se référer au tableau 1 pour le protocole du thermocycleur spécifique au type de banque.
Etape 4: Clean up PCR
Après enrichissement par PCR After enrichment PCR, clean up each reaction using either Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter Genomics part # A63881) or Qiagen MinElute PCR purification kit (Qiagen, part # 28004).
Etape 5: Validation des banques
* Pour vérifier la taille des fragments de PCR enrichis, vérifier la distribution par taille en effectuant une électrophorèse sur gel.
* Utiliser le coffret KAPA Library Quantification approprié pour quantifier avec précision le nombre de molécules de PCR compétente. La quantification précise des banques de molécules est essentielle pour une utilisation efficace des plate-formes de séquençage Illumina. La surestimation de la concentration des banques résulte à une densité moindre des clusters suite à la bridge PCR. La sous-estimation de la concentration des banques est due à des amas trop nombreux dans l'écoulement de cellules, ce qui peut conduire à une pauvre résolution de clusters. Les deux scénarios sont dus à la capacité de séquençage optimale.
La quantification précise des banques est également importante lors de la mise en place de banques indexés pour le séquençage des multiplexés afin d'assurer une représentation équitable de chaque banque.