ELISA à coater soi-même

I. Matériels requis

Réactifs
- Un premier anticorps primaire de capture, spécifique de votre(s) molécules d'intérêt
- Un deuxième anticorps primaire de détection, spécifique de votre(s) molécules d'intérêt
- Une recombinante (ou standard) servant d'étalon
- Solutions de détection: streptavidine-HRP et TMB

Tampons
- Tampon de marquage : PBS
- Tampon de blocage: PBS avec 5%de BSA
- Tampon de lavage: PBS avec 0,05%de Tween
- Diluant pour gamme étalon et échantillon: PBS avec 1%de BSA
- Tampon de fin de réaction: H2SO4 dilué

Matériel
- Plaques à 96 puits
- Plaque covers/sealers
- Pipettes graduées de 5 ml et 10 ml
- Micropipettes monocanal de 20 µl à 1.000 µl avec embouts jetables
- Micropipettes multi-canaux de 50 µl to 300 µl avec embouts jetables
- Béchers, flacons et bouteilles nécessaires pour la préparation des solutions
- Dispositif pour la distribution de solution de lavage (flacon de lavage multi-canaux ou système de lavage automatique)
- Lecteur de microplaques (lecture à 450 nm)


II. Durée de l'expérimentation
- 1 à 2h de marquage
- 3h de procédure
- 30 min de lavage divers
- 10 min de lecture
- TOTAL : 4 à 5 heures


III. Mode opératoire
Revêtement (coating)
- Diluer l'anticorps primaire de capture à la concentration appropriée (as per insert) en utilisant le tampon de marquage (10 ml de volume final requis par plaque)
- Ajouter 100 µl de la solution d'anticorps de capture dans tous les puits de la plaque, couvrir et incuber toute la nuit à 4°C
- Aspirer le contenu de chaque puits, puis laver la plaque au moins deux fois avec 400 µl de tampon de lavage dans chaque puits

Note : Après le dernier lavage s'assurer que tout le tampon a été retiré en mettant un buvard sur de papier absorbant

- Ajouter 250 µl de tampon pour arrêter la réaction dans tous les puits de la plaque, couvrir et incuber à température ambiante pendant 2 heures
- Aspirer le contenu de chaque puits, ensuite laver la plaque au moins deux fois avec 400 µl de tampon de lavage dans chaque puits

Procédure de dosage
- Ajouter 100 µl d'étalon préparé, échantillon et de dilutions de contrôle dans les puits appropriés, couvrir la plaque et l'incuber à température ambiante pendant 1 heure minimum
- Aspirer le contenu de chaque puits, ensuite laver la plaque au moins deux fois avec 400 µl de tampon de lavage dans chaque puits
- Ajouter 100 µl d'anticorps de détection dilué (diluted as per insert) dans tous les puits, recouvrir la plaque et incuber à température ambiante pendant 1 heure au minimum
- Aspirer le contenu de chaque puits, puis laver la plaque au moins deux fois avec 400 µl de tampon de lavage dans chaque puits
- Ajouter 100 µl de solution Streptavidine-HRP dans tous les puits, recouvrir la plaque et incuber à température ambiante pendant 30 min
- Aspirer le contenu de chaque puits, puis laver la plaque au moins deux fois avec 400 µl de tampon de lavage dans chaque puits
- Ajouter 100 µl de solution TMB dans tous les puits, couvrir la plaque et incuber pendant 10 min au minimum à température ambiante

Note : Le temps d'incubation des substrats de la solution est généralement déterminé par les résultats du lecteur d'ELISA. Beaucoup de lecteurs d'ELISA enregistrent uniquement l'absorbance jusqu'à 2 unités de D.O. Par conséquent, la formation de la couleur dans les micropuits peut être observé par l'analyste, et la réaction du substrat stoppée dans les puits positifs avant que cela ne soit plus enregistrable

- Ajouter 100 µl de solution d'arrêt de réaction dans tous les puits et au bout de 30 min mesurer l'absorbance à 450 nm (le cas échéant avec une longueur d'onde de 620 nm, 610-650 est acceptable)