Protocole général d'immunohistochimie (IHC)

Protocole général d'immunohistochimie (IHC)




I. Matériels requis
Réactifs
- Un (ou plusieurs) anticorps primaire couplé(s) ou non et spécifiques de votre(s) molécule(s) d'intérêt
- Kit de révélation
- Chromogène

Tampons
- Xylène
- Bains d'alcool à 70%, 80%et 95%
- Péroxyde d'hydrogène (H2O2)
- Tris EDTA, Tris HCl
- Tween-20

Matériel
- Des pipettes et un Pipet-aid
- Bain-marie


II. Durée de l'expérimentation
- 10 min de blocage des péroxydases
- 30 min de démasquage antigénique
- 1 h d'incubation de l'anticorps pirmaire
- 10 min de chromogène
- 2 h de bains et de rinçages divers
- TOTAL : 4 heures


III. Mode opératoire
- Déparaffiner la section dans 3 bains de xylène de 5 minutes chacun.
- Laver la section dans des bains d‘alcool benzylique à 96%, 80%et 70%pendant 5 minutes chacun.
- Rincer à l'eau distillée.
- Bloquer les peroxydases endogènes en incubant le tissu dans du peroxyde d'hydrogène (H2O2) 3%pendant 10 min.
- Rincer à l'eau distillée.
- Pour démasquer l'antigène : immerger la lame dans du tampon Tris-EDTA buffer, pH 9.0, 0.05%Tween- 20*, et incuber à 95°C dans un bain-marie pendant 30 minut es. (Sinon adapter à votre protocole interne en gardant le pH requis)
- Sortir la lame à température ambiante et la laisser refroidir dans du tampon Tris-EDTA buffer, pH 9.0 pendant 15 min.
- Rincer à l'eau distillée.
- Laver dans du tampon Tris-Hcl 0,05 M (pH 7,6) avec 0,2%de Tween-20 (Tampon A) pendant 5 minutes.
- Appliquer sur le tissu l'anticorps primaire dilué dans du tampon Tris-Hcl 0,05 M (pH 7,6) avec 0,05%de Tween- 20 selon une dilution comprise entre 1/100 et 1/200 pendant 1 heure en chambre humide.
- Laver 2 fois pendant 5 minutes dans le tampon A.
- Appliquer l'anticorps secondaire (le protocole dépend du fournisseur) et appliquer le protocole standard d'immunohistochimie (HRP – Peroxyde – DAB).
- Laver 2 fois pendant 5 minutes dans le tampon A.
- Ajouter le chromogène (DAB), laisser 10 minutes.
- Rincer à l'eau.
- Colorer à l'hématoxyline pendant 5 minutes.
- Laver à l'eau pendant 10 minutes.
- Déshydrater le tissu dans 2 bains d‘alcool benzylique à 96%pendant 5 minutes chacun.
- Laver le tissu dans 2 bains de xylène pendant 2 minutes chacun.
- Monter la lame pour l'observation.