Visualisation des protéines par UV dans les gels pré-coulés nUVIEW

Visualisation des protéines par UV dans les gels pré-coulés nUVIEW


Tous les gels pré-coulés nUView contiennent une formule unique permettant de visualiser les protéines en seulement 2 minutes avec une lampe ultraviolet (UV) - vous permettant d'analyser vos résultats plus rapidement que tout autre gel sur le marché!


Avec la technologie nUView, vous n'avez plus besoin de colorer et décolorer vos gels, ce qui augmente la récupération des protéines et vous fait gagner un temps précieux tout en obtenant de meilleurs résultats.

Visualisation des protéines dans le système SDS-PAGE nUView


La méthode SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis) est probablement l'outil analytique le plus commun et le plus ancien utilisé en chimie des protéines [Laemmli, 1970].

Le procédé est utilisé pour séparer les protéines en fonction de leur mobilité électrophorétique ce qui en SDS-PAGE est fonction de la longueur de la chaîne polypeptidique ou du poids moléculaire dû aux protéines dans les échantillons ayant une charge par unité de masse presque identique due à la liaison du SDS.

La visualisation utilise généralement des colorants textiles tels que le bleu brillant de Coomassie (CBB). Ces approches, comme d'autres, telles que la coloration à l'argent, les colorants fluorescents et la fixation de métaux lourds, sont des méthodes prolongées de coloration. La plupart de ces méthodes utilisent des réactifs coûteux, posent des problèmes d'élimination des déchets ou nécessitent des systèmes d'imagerie spécialisés.

Visualisation par UV

En revanche, les gels nUView permettent de visualiser les bandes de protéines séparées en illuminant le gel sur un trans-illuminateur UV standard tel que celui couramment utilisé dans les laboratoires de biologie moléculaire pour la visualisation de l'ADN avec des colorants interchélatants (par exemple le bromure d'éthidium).

L'acide aminé tryptophane est naturellement fluorescent, mais pas dans le spectre visible. La formation de produits d'addition photo-induits entre le tryptophane et le composé trihalocomposé, sous illumination UV, entraîne la fluorescence des protéines dans le visible, avec une excitation par la lumière UV.

Les résultats optimaux dépendent de la longueur d'onde du trans-illuminateur, des filtres en place et du système de caméra utilisé pour documenter la fluorescence. Les bandes peuvent être vues dans les 2 minutes suivant l'exposition aux UV. Par conséquent, il faut optimiser les conditions pour tout système de documentation sur gel et chaque trans-illuminateur UV.

Une exposition prolongée peut entraîner une augmentation de l'intensité de la fluorescence. Cependant, les temps d'exposition cumulés aux UV modifieront le produit d'addition du tryptophane à une forme non fluorescente, de sorte que les bandes de protéines diminuent (au bout d'environ 7 minutes) et ne sont plus visibles sous un éclairage UV.

Optimisation du processus

Utilisez un trans-illuminateur UV avec des tubes UV qui fournissent une longueur d'onde comprise entre 250 et 320 nm. 300-310 nm est préféré mais les autres peuvent être optimisés. Pour déterminer le temps d'éclairage optimal, vous pouvez utiliser un gel avec une gamme de concentrations de charge d'un échantillon couramment utilisé ou des étalons de poids moléculaire. Retirer le gel de la cassette, rincer brièvement avec de l'eau (ne pas tremper le gel) et placer directement sur le trans-illuminateur (le rinçage peut être omis, cependant les sels dans le tampon de surface sur le gel peuvent être corrosifs pour des parties du transilluminateur). Allumez la lumière UV et exposez le gel pendant 2 minutes. Il est possible de surveiller le développement du gel en temps réel.

Optimisez les paramètres de votre appareil photo (arrêt F, mise au point, etc.). À 2 minutes et à intervalles réguliers jusqu'à 10-15 minutes (plus longtemps, vous remarquerez une diminution de l'intensité) prenez des photos / images du gel exposé. Comparez les images et sélectionnez le temps de détection optimal.

Applications

La méthode nUView offre des avantages en électroblotting pour évaluer / documenter un gel avant Western blotting [Ladner et al., 2004] et autoradiographie; comme il ne nécessite pas de gel répliqué, le gel original peut être remis sur le transilluminateur après le transfert pour évaluer le degré de transfert de protéines dans la membrane.

Les bandes visualisées par nUView peuvent être excisées et analysées par spectrométrie de masse. Les bandes visualisées avec la méthode nUView pourraient être digérées et appliquées directement aux plaques MALDI / TOF [Ladner et al., 2006]. Les protéines doivent être fixées avant d'être digérées et d'éluer les peptides du gel pour l'analyse LC-MS.

Les gels visualisés nUView peuvent être sur-colorés par n'importe quelle méthode - CBB, argent, Sypro, zinc / cuivre, etc. Ainsi, la méthode nUView permet une visualisation instantanée, qui peut ensuite être suivie par des techniques d'imagerie standard. En outre, cette combinaison fournit une image plus complète de toutes les protéines de l'échantillon, car toutes les protéines ne sont pas nécessairement détectables par une seule méthode de visualisation. Les protéines membranaires peuvent être plus facilement visualisées avec nUView qu'avec CBB en raison de la teneur en tryptophane de cette classe de protéines.

Références