Protocole général

Composition du coffret:

Le KAPA2G Fast Multiplex Mix (2X) est un cocktail prêt-à-l'emploi contenant tous les composants pour une PCR en multiplex rapide, à l'exception des amorces et de l'ADN matrice. Le Multiplex Mix contient l'ADN polymérase KAPA2G Fast HotStart (1U par mélange réactionnel de 25 μl), le tampon A KAPA2G (1.5X à 1X), les dNTPs (0.2 mM de chaque à 1X), du MgCl2 (3.0 mM à 1X) et des stabilisateurs.

1. Mise en place de la réaction

Une réaction typique de PCR en multiplex avec le coffret KAPA2G Fast Multiplex PCR est composé des éléments suivants:

	Concentration finale	Volume dans un mélage réactionnel de 25μl
Eau PCR	–	Jusqu' à 25.0μl
KAPA2G Fast Multiplex Mix (2X)	1X	12.5μl
Amorce sens (10μM)	0.20μM	0.50μl
Amorce antisens	0.20μM	0.50μl
Matrice ADN	Selon besoins	10– 250 ng

2. Paramètres des cycles

Les protocoles recommandés pour la PCR en multiplex avec le coffret KAPA2G Fast Multiplex PCR sont décrits dans la tableau ci-dessous:

ETAPE du CYCLE	LOW PLEX ≤5 amplicons,≤1000 bp ≤10 amplicons,≤500 bp	MEDIUM PLEX ≤10 amplicons,≤1000 bp ≤20 amplicons,≤500 bp	HIGH PLEX ≤10 amplicons,≤1500 bp ≤30 amplicons,≤1000 bp
Dénaturation initiale	3 min à 95 °C	3 min à 95 °C	3 min à 95 °C
Dénaturation	15 sec à 95 °C	15 sec à 95 °C	15 sec à 95 °C
Hybridation (Note 1)	30 sec à 60 °C	30 sec à 60 °C	30 sec à 60 °C
Elongation (Note 2)	15– 30 sec à 72 °C	30– 60 sec à 72 °C	60– 90 sec à 72 °C
Nombres de cycles (Note 3)	30	30	30
Elongation finale (optionnelle) (Note 4)	1– 10 min à 72 °C	1– 10 min à 72 °C	1– 10 min à 72 °C

Remarques:
1. L'hybridation doit être réalisée pendant 30 sec/cycle. Commencer avec une température d'hybridation de 60 °C.
2. Le temps d'élongation minimale est de 15 sec/cycle. Selon la taille et la complexité du dosage multiplex, un temps jusqu'à 90 sec/cycle peut être utilisé (en particulier pour les longs fragments d'ADN, les réactions fortement multiplexés).
3. Ne pas effectuer plus de 30 cycles, cela entraînerait une amplification inégale des fragments.
4. L'élongation finale est requise uniquement si les fragments seront TA clonés, ou si les produits de réaction vont être analysés par électrophorèse capillairefluorescente.

3. Résultats

PCR multiplex (4 - et 8-plex) réalisée avec le KAPA2G Fast Multiplex PCR Kit, le concurrent Q et le concurrent I. Les réactions (25 µl) contenait 1X PCR Master Mix (KAPA et compétiteur Q) ou 1X tampon PCR, 3 mM de MgCl2, 0,2 mM de chaque dNTP et 1 U d'ADN polymérase Hot Start. L'ADN génomique humain a été utilisé comme matrice (250 ng - 2 ng par réaction), et 0,2 µM de chaque amorce ont été utilisés. Les cycles d'amplification ont été effectués conformément aux recommandations des fabricants (30 cycles).