Protocole général

Les KAPA Blood PCR Kits contiennent l'ADN polymerase KAPA Blood, une enzyme de seconde génération issue d'un processus moléculaire et la première ADN polymérase destinée spécifiquement à l'amplification directe de l'ADN à partir de sang total. L'enzyme est disponible dans 2 mix PCR optimisés qui contiennent toutes les composants nécessaires exceptés les amorces et les échantillons (sang). Les fragments d'ADN peuvent être amplifiés directement à partir de sang humain sans pré-traitement ni extraction d'ADN, ce qui réduit de façon significative les risques de contamination et le temps de manipulation.
Le KAPA Blood PCR Mix A est préférable pour les tests utilisant des systèmes de détection en fluorescence très sensibles. Le KAPA Blood PCR Mix B est optimisé pour des rendements plus élevés et des fragments riches en GC et est recommandé pour l'analyse en gel d'agarose et coloration au bromure d'éthidium. Les produits de PCR obtenus avec les KAPA Blood PCR Mix A et B peuvent être analysé par séquençage ou dHPLC.

Remarques:

• Amplification direct des fragments d'ADN à partir de sang collecté dans des tubes EDTA
• Ne convient pas les échantillons de sang collectés dans des tubes héparine.
• Pour l'amplification des fragments riches en GC, mettre 5%de DMSO.

1.Volumes de réaction

Composant	Cancentration Final	Pour 50 µl de réaction	Pour 25 µl de réaction	Pour 10 µl de réaction
Eau PCR		Ajuster à 50 µl	Ajuster à 25 µl	Ajuster à 10 µl
Amorce sens (5μM)	0.25μM	2.50μl	1.25μl	0.50μl
Amorce anti-sens (5 μM)	0.25μM	2.50μl	1.25μl	0.50μl
DMSO (100%) ou Tween 20® (2%)	(5%or 0.1%v/v)	(2.50μl)	(1.25μl)	(0.50μl)
KAPA Blood PCR Mix A or B (2x)	1x	25.0μl	12.5μl	5.00μl
Echantillon de sang	10%v/v	5.0μl	2.50μl	1.0μl

2. Paramètres des cycles

Etape du cycle	Temps et température
Dénaturation initiale	5 min à 95ºC
Dénaturation	30 sec à 95ºC
Hybridation	30 sec à Th optimale (selon les amorces)
Extension	1 min/kb à 72ºC
Nombre de cyles	30 - 40
Extension finale	0 - 1 min/kb à 72ºC

3. Produits

Désignation	Conditionnement	Référence
KAPA Blood Readymix PCR Kit A	500 rxn	KK7002
	1 000 rxn	KK7004
KAPA Blood Readymix PCR Kit B	500 rxn	KK7003
	1 000 rxn	KK7005

4. Résultats



Amplification d'un fragment de 459 pb de l'exon 19 du gène humain de la dystrophie musculaire de Duchenne directement à partir de sang humain total, à utilisant le KAPA sang PCR Mix B.