Protocole de RT-PCR quantitative 1-step pour LightCycler® 480
Ce protocole est destiné à être utilisé avec l'instrument de LightCycler Roche ® 480.
Protocole KAPA™ SYBR® FAST One-Step qRT-PCR Kit Optimized for Roche LightCycler® 480
Réactifs :
- Matrice ARN
- Amorce sens
- Amorce antisens
- KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2X)
- ROX Reference Dye Low/High (50X)
- dUTP
- KAPA RT Mix (50X)
Protocole général de qPCR
Etape 1: Réaction d'installation de la qPCR
- Avant la préparation des réactions de qPCR reactions, bien mélanger l'ARN matrice, les amorces, le KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2X), le KAPA RT Mix (50X), les dUTP (10 mM) et le ROX Reference Dye High/Low.
- Conservez tous les composants coffret et assembler faire les réactions dans la glace pour éviter la synthèse prématurée de l'ADNc.
- L'apport recommandé d'ARN est de 1 pg à 100 ng d'ARN total.
- Préparer un cocktail de réaction afin de réduire les erreurs de pipetage. Distribuer des aliquots égaux dans les tubes de réaction. Ajouter l'ARN à chaque réaction comme étape finale. L'ajout de 2 à 5μl d'ARN permettra d'améliorer la précision du dosage.
- Inclure un contrôle sans matrice (NTC) et contrôle de non RT (NRT) lorsque cela est nécessaire. La NTC permettra la détection de la contamination dans les composants de la réaction. Le contrôle NRT teste l'ADN génomique contaminant dans la réaction.
- Calculer les volumes requis de chaque composant selon le tableau suivant:
| Concentration finale | 20μl rxn | |
| Eau de qualité PCR jusqu'à 20μl | Selon besoins | |
| KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2X) | 1X | 10μl |
| Amorce sens (10μM) | 200 nM | 0.4μl |
| Amorce antisens (10μM) | 200 nM | 0.4μl |
| dUTP (10 mM) (optionnel) | 200μM | 0.4μl |
| Colorant de référence ROX | Inclus dans le Master Mix à la concentration finale de 500nM | N/A |
| KAPA RT Mix (50X) | 1X | 0.4μl |
| Matrice ARN | variable | < 5μl |
Etape 2: Configuration de la plaque
- Transférer le volume approprié de mélange réactionnel dans chaque puits d'une plaque ou sans un tube de PCR. Les volumes réactionnels peuvent être réduits de 20μl à 10μl si des tubes/plaques de faible volume sont utilisés.
- Couvrir ou sceller le tube/la plaque de réaction et centrifuger brièvement.
Etape 3: Exécution de la réaction qPCR
- Programmer le protocole suivant:
| Nom du programme | Cycles | Mode d'analyse | |
| Rétrotranscription | 1 | Aucun | |
| Amplification | 40 (1) | Quantification | |
| Courbe de fusion | 1 | Courbes de fusion | |
| Refroidissement | 1 | Aucun | |
| Nom du programme | Cible (ºC) | Mode d'aquisition | Durée (hh:mm:ss) |
| Rétrotranscription | 42°C | Aucun | 00:05:00 |
| 95°C | Aucun | 00:03:00 (2) | |
| Amplification | 95°C | Aucun | 00:00:10 |
| Selon amorce (3) | Aucun | 00:00:20 (4) | |
| 72°C | Unique | 00:00:01 (5) | |
| Courbe de fusion | 95°C | Aucun | 00:00:05 |
| 65°C | Aucun | 00:01:00 | |
| 97°C | Continu | 5 - 10 Acquisitions/°C | |
| Refroidissement | 40°C | Aucun | 00:00:10 |
(1) 40 cycles conviennent à la plupart des tests, mais cela peut être réduit en fonction de la concentration initiale de la cible.
(2) 20 sec à 95 °C est le temps nécessaire pour l'activation de l'ADN polymérase, cependant 3 min sont nécessaire pour inactiver totalement la reverse transcriptase avant le cycle.
(3) Les amorces qPCR sont généralement conçus pour une hybridation optimale à 60 °C, cependant les températures optimales d'hybridation peuvent différer des valeurs calculées.
(4) Il n'est pas recommandé d'utiliser moins de 20 sec pour l'hybridation des amorces.
(5) En raison de la processivité élevée de l'ADN polymérase KAPA SYBR®, seulement 1 sec à 72 °C est suffisant pour l'élongation des amplicons <400 bp.
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