Western blot-verbruiksartikelen omvatten de producten die nodig zijn om eiwitten van een elektroforesegel naar een vaste drager over te brengen en deze vervolgens immunologisch te detecteren. Western blotting is gebaseerd op deze overdracht naar een ondersteunend membraan, gevolgd door immunodetectie, waardoor het een veelgebruikte techniek is voor de visualisatie en identificatie van eiwitten. Deze categorie omvat voornamelijk transfermembranen, blotting-filterpapier, transfer- en wasbuffers, evenals blokkerings- en detectiereagentia.
Belangrijkste componenten
De transferdrager bestaat doorgaans uit een van twee materialen: nitrocellulose of polyvinylideenfluoride (PVDF), die beide eiwitten met hoge affiniteit binden. PVDF-membranen moeten vóór gebruik worden bevochtigd in 100% methanol, hoewel ze daarna kunnen worden gebruikt met een transferbuffer zonder methanol. Blotting-filterpapier, gemaakt van 100% katoenvezel, zorgt voor een gelijkmatige bufferstroom door de gel en bevat geen additieven die het transferproces kunnen verstoren. Het is verkrijgbaar in standaarddikte en extra dikke uitvoeringen, waarbij de laatste wordt aanbevolen voor semi-droge transfers vanwege de grotere vloeistofcapaciteit. De transferbuffer die wordt gebruikt bij elektroblotting bestaat meestal uit Tris-base, glycine en methanol (waarbij de concentratie afhankelijk is van het specifieke protocol), terwijl een TBST-wasbuffer (Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,05% Tween-20) en een blokkeerbuffer (bijvoorbeeld 5% runderserumalbumine) worden gebruikt in de daaropvolgende stappen. Blokkeringsreagentia moeten alle ongereageerde bindingsplaatsen op het membraan verzadigen zonder het doelwit-eiwit te verwijderen of de werking van antilichamen of detectiereagentia te beïnvloeden.
Formaten en toepassingen
Voorgesneden membranen en filterpapieren, evenals vooraf samengestelde transfer-sandwiches, zijn tegenwoordig beschikbaar en afgestemd op de afmetingen van de gel, waardoor de procedure eenvoudiger en sneller wordt. Sommige systemen integreren een vooraf geactiveerd transfermembraan rechtstreeks in een verbruikbare stapel, waardoor droge transfer binnen enkele minuten mogelijk is. Afhankelijk van de gebruikte detectiemethode (colorimetrisch, chemiluminescent of fluorescent), kan de keuze van het membraan invloed hebben op het signaal en de achtergrond. Zo zijn PVDF-membranen met lage autofluorescentie ontwikkeld om achtergrondruis bij fluorescentie-gebaseerde detectie te verminderen. Elektroforetische transfer kan worden uitgevoerd onder natte of semi-droge omstandigheden, waarbij natte transfer over het algemeen als betrouwbaarder wordt beschouwd, vooral voor grotere eiwitten, omdat het risico dat de gel uitdroogt wordt verminderd.
