Hot-start NeoTaq II DNA polymerase
Referentie NB-60-0008
Formaat : 500U
Merk : Neo Biotech
Datasheet (EN)
NeoTaq II-DNA-polymerase met hot-start-functie
Beschrijving
- Hot-start NeoTaq II DNA-polymerase is een gemodificeerde DNA-polymerase met hot-start-achtige PCR-activiteit.
- Beperkte activiteit bij kamertemperatuur helpt unspectifische primerverlenging en primer-dimeervorming te voorkomen.
- Biedt een hogere PCR-specificiteit, gevoeligheid en DNA-opbrengst.
- Geactiveerd in 5 minuten bij 95°C voor een snelle reactiestart.
- Ondersteunt de amplificatie van DNA-sjablonen tot 6 kb met snelle verlengingstijden van 15–30 s/kb.
- Vereist minimale PCR-optimalisatie en maakt het opzetten van reacties bij kamertemperatuur mogelijk.
- Hot-start NeoTaq II DNA-polymerase heeft geen 3′→5′-exonuclease (proofreading) activiteit.
- Genereert PCR-producten met 3′ A-overhangs, geschikt voor TA-klonering met PCR-kloneringskits.
Opslagomstandigheden en bereiding van reagentia
Dit product moet worden bewaard bij -85 °C tot -15 °C in een vriezer zonder ontdooicycli om een maximale houdbaarheid te garanderen. Het product blijft stabiel tot de vervaldatum indien bewaard zoals gespecificeerd.
Kwaliteitscontroleassay
Zuiverheid
De zuiverheid van Hot-start NeoTaq II DNA-polymerase is > 90% zoals beoordeeld door SDS-polyacrylamidegelelektroforese gevolgd door Coomassie Blue-kleuring.
Genomische DNA-contaminatie
Het product moet voldoen aan de interne standaarden voor DNA-contaminatie zoals geëvalueerd via real-time qPCR.
Nuclease assays
0,2-0,3 μg plasmide-DNA wordt geïncubeerd met 5 U Hot-start NeoTaq II DNA-polymerase, in 1× reactiebuffer, gedurende 14-16 uur bij 37 °C. Na incubatie wordt het DNA gevisualiseerd op een met Safe DNA Gel Stain gekleurd agarosegel. Er mag geen zichtbare inkeping of knip van het nucleïnezuur zijn. Vergelijkbare tests worden uitgevoerd met Hot-start NeoTaq II-buffer en MgCl2-oplossing.
Functionele assay
Hot-start NeoTaq II DNA-polymerase wordt uitvoerig getest op prestaties in een polymerasekettingreactie (PCR) van DNA-fragmenten van verschillende grootte (1 en 2,5 kb) uit humaan genomisch DNA. De resulterende PCR-producten worden gevisualiseerd als enkele banden in een met Safe DNA Gel Stain gekleurd agarosegel. Vergelijkbare functionele tests worden uitgevoerd met Hot-start NeoTaq II-buffer en MgCl2-oplossing.
Probleemoplossing
Geen productamplificatie of lage opbrengst
• Ongeschikte annealingstemperatuur
De samenstelling van de reactiemix kan de smelteigenschappen van primers en DNA beïnvloeden. Pas de annealingstemperatuur aan om deze af te stemmen op de primer met de laagste smelttemperatuur (5 °C tot 10 °C lager dan Tm).
• Aanwezigheid van PCR-remmers
Sommige DNA-isolatieprocedures, met name de isolatie van genomisch DNA, kunnen leiden tot de co-zuivering van PCR-remmers. Verlaag het volume sjabloon-DNA in de reactie of verdun het sjabloon-DNA voordat het aan de reactie wordt toegevoegd. Zelfs een verdunning van monsters met 1:10.000 is effectief gebleken om de resultaten te verbeteren, afhankelijk van de initiële DNA-concentratie.
• Additieven vereist
Het toevoegen van PCR-versterkende middelen (5× Optimizer Solution of 2× GC-Enhancer Solution) kan de opbrengst verbeteren en tegelijkertijd de amplificatie van moeilijke sjablonen mogelijk maken.
Aanwezigheid van unspectifische banden
• Unspectifische annealing van primers
Pas de annealingomstandigheden aan en/of ontwerp een andere set primers door de lengte te vergroten en complementaire sequenties te vermijden.
• Mg2+-concentratie is te hoog
Over het algemeen werkt 1,5-3 mM MgCl2, typisch een eindconcentratie van 2,5 mM, goed voor de meerderheid van de PCR-reacties. De optimale concentratie hangt af van het doelsjabloon, de buffer en dNTP's. Optimaliseer de magnesiumconcentratie door MgCl2 toe te voegen in stappen van 0,5 tot 4 mM.