Os anticorpos secundários podem ser classificados com base em sua especificidade, que pode ser ampla ou estreita, e em seu tipo de fragmento, que pode ser inteiro, F(ab) ou F(ab')2.

O princípio do F(ab')2 é gerar fragmentos de anticorpos divalentes que retêm as porções Fab de ligação ao antígeno dos anticorpos IgG inteiros, enquanto removem a maior parte da região Fc.

Os fragmentos F(ab')2 são gerados por digestão com pepsina dos anticorpos IgG inteiros para cortar a região da dobradiça e deixar intacta parte da região Fc. Os fragmentos resultantes têm duas porções Fab de ligação ao antígeno ligadas por pontes dissulfeto, tornando-os divalentes com um peso molecular de cerca de 110 kDa. O uso de fragmentos F(ab')2 tem várias vantagens em relação aos anticorpos IgG inteiros, incluindo melhor penetração nos tecidos, redução da ligação não específica aos receptores Fc em células vivas ou à proteína A/G, e a capacidade de precipitar antígenos. No entanto, os fragmentos F(ab')2 não são recomendados para bloqueio, pois possuem dois locais de ligação disponíveis para capturar o anticorpo primário que será introduzido posteriormente. A preparação dos fragmentos F(ab')2 envolve a digestão com pepsina dos anticorpos IgG inteiros, seguida de purificação usando técnicas como FPLC com DEAE-