Consumíveis para Western blot incluem os produtos necessários para transferir proteínas de um gel de eletroforese para um suporte sólido e, em seguida, realizar a sua deteção imunológica. A técnica de Western blot baseia-se nesta transferência para uma membrana de suporte seguida de imunodeteção, tornando-se uma técnica amplamente utilizada para a visualização e identificação de proteínas. Esta categoria inclui principalmente membranas de transferência, papéis de filtro para blotting, tampões de transferência e lavagem, bem como reagentes de bloqueio e deteção.
Componentes principais
O suporte de transferência é geralmente de um de dois tipos: nitrocelulose ou fluoreto de polivinilideno (PVDF), ambos com elevada afinidade de ligação às proteínas. As membranas PVDF devem ser previamente humedecidas em metanol a 100% antes da utilização, embora posteriormente possam ser utilizadas com um tampão de transferência sem metanol. O papel de filtro para blotting, fabricado com fibra de algodão a 100%, proporciona um fluxo uniforme do tampão através do gel e não contém aditivos que possam interferir no processo de transferência. Está disponível em formatos de espessura padrão e extra espessos, sendo o último recomendado para transferências semissecas devido à sua maior capacidade de retenção de líquidos. O tampão de transferência utilizado na eletroblotagem é normalmente constituído por base Tris, glicina e metanol (com concentração dependente do protocolo específico), enquanto um tampão de lavagem TBST (solução salina tamponada com Tris e 0,05% de Tween-20) e um tampão de bloqueio (por exemplo, albumina sérica bovina a 5%) são utilizados nas etapas seguintes. Os reagentes de bloqueio devem saturar todos os locais não reativos da membrana sem remover a proteína-alvo ou interferir com os anticorpos ou reagentes de deteção.
Formatos e aplicações
Atualmente estão disponíveis membranas e papéis de filtro pré-cortados, bem como sanduíches de transferência pré-montados, adaptados diretamente às dimensões do gel, simplificando e acelerando o procedimento. Alguns sistemas integram uma membrana de transferência pré-ativada diretamente numa pilha de consumíveis, permitindo realizar transferências a seco em apenas alguns minutos. Dependendo do método de deteção utilizado (colorimétrico, quimioluminescente ou fluorescente), a escolha da membrana pode afetar o sinal e o fundo. Por exemplo, foram desenvolvidas membranas PVDF de baixa autofluorescência especificamente para reduzir o ruído de fundo em deteções baseadas em fluorescência. A transferência eletroforética pode ser realizada em condições húmidas ou semissecas, sendo a transferência húmida geralmente considerada mais fiável, especialmente para proteínas de maior tamanho, pois reduz o risco de secagem do gel.
