Tampão Laemmli é um sistema de reagentes essencial utilizado em fluxos de trabalho de SDS-PAGE e Western blot para preparar amostras de proteínas para separação eletroforética. Baseado no método descontínuo de eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida descrito por Laemmli, este sistema de tampão ajuda a desnaturar proteínas, padronizar o seu comportamento de migração e melhorar a resolução das bandas antes da transferência para uma membrana para imunodeteção.
Função na preparação de amostras proteicas
O tampão de amostra Laemmli contém normalmente Tris-HCl, SDS, glicerol, azul de bromofenol e, em formulações redutoras, um agente redutor como β-mercaptoetanol ou DTT. O SDS desnatura as proteínas e fornece uma carga negativa uniforme, permitindo a separação principalmente de acordo com o peso molecular. Os agentes redutores rompem as ligações dissulfeto, enquanto o glicerol aumenta a densidade da amostra para carregamento nos poços do gel. O azul de bromofenol funciona como corante marcador para acompanhar o progresso da eletroforese.
Aplicações em fluxos de trabalho de Western blot
No Western blot, o tampão Laemmli é geralmente utilizado antes da eletroforese, após a extração e quantificação das proteínas. As amostras proteicas são misturadas com o tampão e aquecidas para promover a desnaturação antes do carregamento em géis de poliacrilamida. É adequado para análises de SDS-PAGE de rotina, perfil proteico, estimativa do peso molecular e preparação de amostras antes da transferência para membrana. A escolha da concentração adequada do tampão Laemmli, da formulação redutora ou não redutora e das condições de aquecimento ajuda a melhorar a separação proteica, a nitidez das bandas e a reprodutibilidade na deteção posterior por Western blot.
Formatos comuns
- Tampão de amostra Laemmli 2X ou 4X
- Tampão Laemmli redutor contendo β-mercaptoetanol ou DTT
- Tampão Laemmli não redutor para preservar estruturas ligadas por pontes dissulfeto
- Tampão de corrida Tris-glicina-SDS compatível com Laemmli