Os anticorpos primários anti-cavalo conjugados com HRP são imunorreagentes marcados com enzimas para a detecção cromogénica, quimioluminescente e quimioluminescente melhorada (ECL) de antigénios equinos. Produzidos através da imunização de hospedeiros como cabras, coelhos ou ratinhos com imunoglobulinas equinas purificadas, os anticorpos são purificados por afinidade e covalentemente conjugados à peroxidase de rábano (HRP, MW ≈ 40 kDa), uma glicoproteína de origem vegetal com grupos prostéticos heme essenciais para a atividade catalítica. A conjugação é tipicamente alcançada através da oxidação por periodato, oxidando os resíduos de hidratos de carbono da enzima em aldeídos que reagem com as aminas primárias do anticorpo, produzindo ligações de base de Schiff estáveis. O conjugado resultante mantém uma proporção molar de enzima para proteína (E/P) de aproximadamente 3–5, otimizando a eficiência catalítica enquanto preserva a afinidade de ligação ao antigénio. A HRP catalisa a oxidação de vários substratos na presença de peróxido de hidrogénio: o TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina) produz um produto colorimétrico azul mensurável a 450 nm; o DAB (3,3'-diaminobenzidina) origina um precipitado castanho adequado para imuno-histoquímica; e os substratos baseados em luminol geram emissão quimioluminescente detetável por película de raios X ou sistemas de imagem digital. As especificidades disponíveis incluem reagentes anti-IgG (H+L), anti-IgG (Fc), subclasses de anti-IgG (IgG1, IgG2, IgG3) e anti-IgM. Os produtos são tipicamente fornecidos em solução salina tamponada com fosfato com proteínas estabilizadoras como BSA ou gelatina e contêm 40–50% de glicerol para evitar a congelação a –20°C. A adsorção cruzada extensiva contra imunoglobulinas de bovino, ovelha, cabra, coelho e ratinho elimina a ligação não específica em amostras de múltiplas espécies.
Aplicações
Os conjugados de HRP são amplamente empregues em múltiplos formatos de ensaio imunoenzimático para a detecção de antigénios equinos. Em Western blotting, estes anticorpos permitem a detecção quimioluminiscente sensível de proteínas equinas separadas por SDS-PAGE, com diluições típicas que variam de 1:1.000 a 1:50.000, dependendo da abundância do antigénio e da sensibilidade do substrato. Em ELISA, os conjugados de HRP servem como anticorpos de detecção para quantificar títulos de anticorpos equinos, níveis de citocinas ou concentrações de antigénios em soro, plasma e outros fluidos biológicos; os substratos cromogénicos TMB ou quimioluminiscentes fornecem leituras sensíveis tanto em configurações diretas como em sanduíche. Em imuno-histoquímica e imunocitoquímica, a deposição mediada por HRP de DAB ou AEC (3-amino-9-etilcarbazol) produz precipitados permanentes nos locais dos antigénios em tecidos fixados em formalina e incluídos em parafina, cortes congelados ou células cultivadas, permitindo a análise morfológica por microscopia ótica. Em aplicações de dot blot e matrizes de proteínas, estes conjugados fornecem uma detecção robusta para a triagem simultânea de múltiplas amostras. As aplicações adicionais incluem o ensaio imunoenzimático (EIA), microarrays de tecidos e hibridização in situ.
No entanto, a atividade da HRP é inibida pela azida de sódio (comumente utilizada como conservante), exigindo tampões livres de azida para um desempenho ideal. As diluições de trabalho típicas dependem da aplicação: 1:1.000–1:20.000 para Western blotting (quimioluminiscente), 1:1.000–1:100.000 para ELISA e 1:200–1:5.000 para imuno-histoquímica. Estes reagentes destinam-se exclusivamente a fins de investigação e não a procedimentos de diagnóstico.