NeoStress

O ensaio de células vivas antioxidantes Neostress foi desenvolvido a partir da tecnologia Light Up Cell System, que permite uma monitorização precisa da produção intracelular de ROS. A tecnologia foi optimizada para um elevado rendimento em placas de 96 e 384 poços, adequadas para leitores de fluorescência comerciais, de acordo com um protocolo simples que se limita à adição da solução A1 ao meio de cultura e a vinte séries de medições de iluminação/fluorescência.

Mecanismo

O Neostress baseia-se na ativação de um fotossensibilizador intracelular num protocolo que requer apenas uma sucessão de flashes de luz e leituras de fluorescência. O processo é designado por sistema light-up cell porque o nível de fluorescência do biossensor aumenta durante a sua fotoindução por iluminação. O biossensor entra passivamente nas células, mas é rapidamente removido das células funcionais por proteínas de transporte de efluxo, resultando num sinal fluorescente baixo. Quando a luz é aplicada, a fotoindução do biossensor gera ROS intracelulares, que alteram a homeostase celular ou a capacidade da célula para libertar o biossensor, desencadeando a sua entrada maciça no interior das células e resultando num aumento do sinal de fluorescência. O aumento da fluorescência é retardado ou abolido em células previamente incubadas com uma substância antioxidante que actua neutralizando os radicais livres produzidos pelas células sob iluminação.

Características:

• Para 400 pontos de medição em placas de 96 poços
• Procedimento numa só etapa
• Sem lavagens
• Armazenamento a 4°C
• Prazo de validade: 6 meses após a receção
• Procedimento padrão para a maioria das células primárias, hiPSCs, linhas celulares imortalizadas,... (kit de otimização disponível se necessário)
• Pode ser utilizado em multiplexagem

Protocolo geral do ensaio

1. Preparar amostras concentradas 10X
2. Para a condição de controlo positivo, adicionar 63μL de meio de cultura sem soro no tubo de Solução B. Misturar com a pipeta
3. Retirar o meio de cultura das células e, em seguida, adicionar 90μL de meio de cultura sem soro
4. Adicionar 10μL de controlo positivo e condições de amostra aos poços
5. Incubar durante 1h na incubadora
6. Para 96 poços, preparar 3,13μL de Solução A1 + 2596,9μL de meio de cultura sem soro. Misturar com a pipeta
7. Adicionar 25μL desta solução A1 diluída por poço. Evitar a exposição à luz excessiva durante este passo e os passos seguintes.
8. Incubar a placa no tempo determinado durante o protocolo de otimização à temperatura ambiente
9. Ler a fluorescência (Fpre) nos seguintes comprimentos de onda:
10. λExcitação= 505nm (±10nm)
11. λEmissão= 535nm (±10nm)
12. Iluminar a placa utilizando o iluminador AOP (AOPLight B1 ou AOPLight HTS)
13. Ler a fluorescência (Fpost)
14. Repetir as etapas 10 e 11 vinte vezes

N.B.: A fluorescência não específica pode ser medida através da leitura da fluorescência antes da etapa 6.

Segurança

Este produto destina-se apenas a fins de investigação e não a uso humano ou terapêutico. Potencialmente nocivo. Evitar a exposição prolongada ou repetida. Evitar o contacto com os olhos, a pele ou a roupa. Lavar abundantemente após manuseamento. Em caso de contacto com os olhos ou a pele, lavar as áreas afectadas com água abundante durante 15 minutos e consultar um médico. Em caso de inalação ou ingestão, levar a pessoa para uma zona ao ar livre e consultar imediatamente um médico.

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