2. Diferenciação do trofoblasto
A diferenciação do trofoblasto é governada por programas coordenados de sinalização, transcricionais e epigenéticos que regulam a manutenção dos progenitores do citotrofoblasto (CTB) e o compromisso em direção aos estados de sinciciotrofoblasto (STB) e trofoblasto extraviloso (EVT). Estes mecanismos foram investigados utilizando sistemas complementares de células-tronco de trofoblasto humanas e de camundongo, modelos de diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas, culturas primárias de trofoblasto, organoides e embriões de camundongo geneticamente manipulados. Embora várias vias reguladoras sejam compartilhadas, a especificação e diferenciação da linhagem do trofoblasto não estão completamente conservadas entre as espécies; em particular, a linhagem EVT humana não tem um equivalente direto um-para-um no camundongo.
Especificação transcricional e o eixo Hippo/TEAD4
No concepto de camundongo, a atividade diferencial da via Hippo liga a posição celular e o contato intercelular à especificação do trofoblasto. A fosforilação mediada por LATS restringe o YAP nuclear nas células internas, enquanto a atividade reduzida da via Hippo permite a interação nuclear de YAP com TEAD4 nas células externas. A atividade de TEAD4 está, portanto, associada à especificação do trophectoderma e à ativação de programas transcricionais associados ao trofoblasto, incluindo Cdx2. GATA3 atua dentro da rede reguladora associada a TEAD4 e contribui, juntamente com CDX2, para a especificação e diferenciação do trofoblasto no camundongo. A rede transcricional centrada em ELF5 fornece uma camada adicional de regulação das células-tronco do trofoblasto. Alterações na abundância de ELF5 influenciam suas interações com reguladores transcricionais incluindo EOMES e TFAP2C e modificam o equilíbrio entre os programas transcricionais associados à autorrenovação e à diferenciação.
Em modelos de trofoblasto humano, as relações reguladoras entre TEAD4, CDX2, GATA3 e outros reguladores de linhagem são mais complexas e não devem ser assumidas como reprodução direta da hierarquia do camundongo.
Sinalização BMP e compromisso do trofoblasto humano
BMP4 é amplamente utilizado experimentalmente para induzir a diferenciação associada ao trofoblasto a partir de células-tronco pluripotentes humanas. A exposição a BMP4 ativa programas transcricionais associados ao trofoblasto enquanto suprime estados associados à pluripotência em vários sistemas experimentais. Estudos de diferenciação dirigida por BMP4 identificaram um intermediário semelhante ao citotrofoblasto positivo para ΔNp63 em alguns modelos de células-tronco pluripotentes humanas antes da diferenciação subsequente do trofoblasto. Uma rede transcricional GATA2/3–TFAP2A/C também foi associada à aquisição e manutenção da identidade do trofoblasto, enquanto GATA3 contribui para o compromisso do trofoblasto em sistemas de diferenciação baseados em BMP4.
As respostas a BMP4 são fortemente influenciadas pela modulação simultânea de vias concorrentes. Os protocolos de diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas incorporaram, portanto, a inibição da sinalização de Activin/Nodal/TGF-β e FGF para direcionar a diferenciação para estados associados ao trofoblasto. Estas condições são experimentais e dependentes do sistema e não devem ser interpretadas como uma representação universal da especificação ou diferenciação fisiológica do trofoblasto humano.
Sinalização Wnt/β-catenina e diferenciação do trofoblasto
A sinalização canônica Wnt/β-catenina contribui para a regulação e diferenciação das células-tronco do trofoblasto, mas seus efeitos são altamente dependentes do estado celular, do contexto de desenvolvimento e das condições experimentais. A manipulação experimental da sinalização Wnt em modelos de trofoblasto humano pode modificar a proliferação, diferenciação, migração, invasão e a expressão de genes associados à linhagem. Estas observações apoiam um papel da transcrição dependente de Wnt na diferenciação do trofoblasto e nos fenótipos invasivos, mas não estabelecem a ativação de Wnt como um determinante único ou universal da especificação do EVT.
A sinalização Wnt deve, portanto, ser considerada em conjunto com outros mecanismos reguladores de linhagem que controlam a adesão celular, a migração, as interações com a matriz extracelular e o estado de diferenciação do trofoblasto, em vez de como um impulsionador isolado do desenvolvimento do EVT.
Sinalização Notch e TGF-β/SMAD
A sinalização Notch tem um papel estabelecido experimentalmente no desenvolvimento da linhagem do trofoblasto humano. NOTCH1 está associado ao desenvolvimento do EVT, e a manipulação experimental da sinalização de NOTCH1 altera a diferenciação em direção à linhagem extravilosa. NOTCH2 mostra padrões de expressão distintos entre os subtipos de CTB do primeiro trimestre, consistentes com a regulação dinâmica da sinalização da família Notch através das populações de trofoblasto e estados de diferenciação, embora diferenças de expressão não devam ser interpretadas por si só como evidência de um papel funcional específico.
A sinalização TGF-β é similarmente dependente do subtipo de trofoblasto e do estado de desenvolvimento. Análises experimentais da fosforilação, localização e expressão de SMAD2/3 demonstram ativação diferencial da sinalização canônica TGF-β através das populações de trofoblasto do primeiro trimestre. Estes achados apoiam um papel dependente do contexto da sinalização TGF-β/SMAD na diferenciação do trofoblasto em vez de um efeito uniforme em todas as populações de trofoblasto.
Sinalização de hipóxia/HIF e diferenciação do EVT
A disponibilidade de oxigênio representa um regulador ambiental experimentalmente manipulável da diferenciação do trofoblasto. A tensão reduzida de oxigênio pode direcionar CTBs humanos primários para um fenótipo associado ao EVT, e esta resposta depende, pelo menos em parte, da sinalização do fator induzível por hipóxia. Alterações associadas à hipóxia incluem mudanças na morfologia celular, adesão e programas de diferenciação, ligando o eixo hipóxia/HIF/trofoblasto à aquisição de características associadas ao EVT. Estas observações indicam que a sinalização dependente de oxigênio pode modular a diferenciação do trofoblasto, enquanto a resposta precisa permanece dependente da concentração de oxigênio, do estado de desenvolvimento e do modelo experimental.
Cultura de células-tronco de trofoblasto e diferenciação dirigida
As células-tronco de trofoblasto humanas fornecem um sistema experimental para investigar a autorrenovação e a diferenciação da linhagem do trofoblasto. Os sistemas de cultura de TSC humanas estabelecidos incorporam sinalização do fator de crescimento epidérmico, ativação canônica de Wnt, inibição de vias que promovem a diferenciação e inibição de ROCK durante procedimentos de cultura apropriados. No sistema de TSC humanas estabelecido, a modulação adicional do estado epigenético, incluindo a inibição da histona desacetilase, contribui para a manutenção do estado de células-tronco do trofoblasto.
A manipulação experimental de vias pode envolver CHIR99021 para estimular a sinalização canônica Wnt, A83-01 ou inibidores relacionados para suprimir a sinalização de Activin/TGF-β, EGF para apoiar a propagação de células-tronco de trofoblasto e Y-27632 para inibir o estresse celular dependente de ROCK durante procedimentos selecionados. Sistemas de diferenciação baseados em BMP4 podem adicionalmente usar inibidores de vias como A83-01 e, em contextos experimentais específicos, PD173074 para modular sinais concorrentes de TGF-β e FGF. Estes reagentes representam componentes de sistemas experimentais distintos e não devem ser interpretados como uma única formulação padronizada de diferenciação do trofoblasto.
A elevação mediada por forskolina do cAMP intracelular é usada experimentalmente para promover a sincicialização do trofoblasto e fenótipos associados ao STB. Nestes sistemas, a fusão celular é acompanhada por alterações transcricionais e morfológicas associadas à diferenciação do sinciciotrofoblasto.
As TSC de camundongo fornecem um modelo genético complementar no qual reguladores como TEAD4, GATA3, ELF5, EOMES e TFAP2C podem ser manipulados diretamente para investigar a stemness do trofoblasto, a especificação de linhagem e a diferenciação. Achados deste modelo permanecem essenciais para definir mecanismos transcricionais causais, mas devem ser interpretados no contexto das diferenças específicas de espécie no desenvolvimento do trofoblasto.
Organoides de trofoblasto tridimensionais
Os organoides de trofoblasto humanos tridimensionais fornecem um modelo no qual populações progenitoras de CTB podem ser mantidas e diferenciadas dentro de um ambiente multicelular organizado. Sistemas de organoides de trofoblasto humanos reproduzem características importantes do desenvolvimento precoce do trofoblasto placentário e podem gerar populações de trofoblasto diferenciadas relevantes para a biologia do STB e, sob condições experimentais apropriadas, do EVT.
Sistemas de cultura de organoides definidos podem incorporar EGF, modulação da via canônica Wnt, inibição da via TGF-β e componentes adicionais de fatores de crescimento ou matriz extracelular para apoiar a autorrenovação e diferenciação do trofoblasto. Matrizes de matriz extracelular fornecem suporte estrutural para a formação de organoides tridimensionais e organização epitelial. No entanto, a composição da matriz e a disponibilidade de fatores de crescimento podem influenciar o estado celular e a diferenciação, tornando a composição da matriz extracelular uma variável experimental importante.
Análise de célula única e resolução de linhagem
O sequenciamento de RNA de célula única fornece análise de alta resolução da heterogeneidade do trofoblasto que não é obtível a partir de medições transcriptômicas em bulk. Abordagens transcriptômicas de célula única e de inferência de trajetórias identificaram estados de trofoblasto transcricionalmente distintos e permitiram a inferência de relações de desenvolvimento entre CTBs progenitores, CTBs em diferenciação, populações associadas ao STB e populações associadas ao EVT. Estas abordagens também facilitam a comparação de tecido placentário primário com modelos de células-tronco de trofoblasto e organoides.
A inferência de trajetórias e análises pseudotemporais devem, no entanto, ser interpretadas como modelos computacionais de relações de desenvolvimento em vez de prova experimental direta de transições de linhagem. Análises complementares de rastreamento de linhagem, perturbação, funcionais e temporais são necessárias para estabelecer relações causais de linhagem.
No camundongo, a manipulação genética de linhagem e abordagens de perda ou ganho de função fornecem evidência complementar para relações causais entre a atividade de fatores de transcrição e o destino do trofoblasto. A manipulação experimental de Tead4, Gata3 e Elf5, juntamente com análises de diferenciação de células-tronco e de embriões, foi usada para distinguir reguladores necessários para a identidade do trofoblasto de fatores associados secundariamente à diferenciação.
Validação molecular e celular
A validação da diferenciação do trofoblasto geralmente requer medições moleculares, celulares e funcionais concordantes. KRT7/CK7 é amplamente usado como marcador associado ao trofoblasto, embora não seja exclusivamente específico para trofoblastos. A expressão associada a CGB/hCG é frequentemente avaliada durante a diferenciação do STB e reflete programas endócrinos do trofoblasto e associados à sincicialização em vez de constituir um marcador definitivo independente da identidade do STB. HLA-G é comumente usado para identificar populações associadas ao EVT, particularmente EVT diferenciado/invasivo, mas deve igualmente ser interpretado juntamente com marcadores de linhagem adicionais e propriedades funcionais.
Imunofluorescência, imuno-histoquímica, citometria de fluxo, RT-PCR quantitativa, western blotting e perfilamento transcriptômico fornecem abordagens complementares para definir fenótipos associados à linhagem. Análises funcionais podem ainda avaliar a fusão celular, migração, invasão, adesão e interações com a matriz extracelular, permitindo que a expressão de marcadores moleculares seja interpretada juntamente com o fenótipo celular.
Para o STB, a formação de sincício e alterações moleculares associadas à fusão são particularmente informativas, enquanto estudos de EVT comumente incorporam ensaios de migração e invasão juntamente com a expressão de HLA-G e marcadores adicionais associados ao EVT. Combinar medições moleculares, morfológicas e funcionais é, portanto, preferível a atribuir a identidade do trofoblasto com base em um único marcador.
Visão integrada da diferenciação do trofoblasto
Coletivamente, os estudos experimentais apoiam um modelo no qual os mecanismos de diferenciação do trofoblasto surgem de uma rede interativa de sinalização dependente de Hippo/TEAD4, BMP, Wnt/β-catenina, Notch, TGF-β/SMAD e HIF juntamente com fatores de transcrição reguladores de linhagem incluindo CDX2, GATA3, TEAD4, TFAP2C e ELF5. A contribuição relativa de cada via depende da espécie, do estágio de desenvolvimento, do estado celular e do contexto experimental. Suas interações regulam a manutenção das células-tronco do trofoblasto, o compromisso de linhagem, a fusão do sinciciotrofoblasto e a invasão do trofoblasto extraviloso, enquanto contribuem para os programas celulares subjacentes ao desenvolvimento placentário precoce.