NeoTaq II-DNA-polymerase met hot-start-functie
Descrição
- ADN polimerase Hot-start NeoTaq II é uma ADN polimerase modificada com atividade de PCR semelhante a hot-start.
- A atividade limitada à temperatura ambiente ajuda a prevenir a extensão inespecífica de primers e a formação de dímeros de primers.
- Fornece maior especificidade, sensibilidade e rendimento de ADN na PCR.
- Ativada em 5 minutos a 95°C para um início rápido da reação.
- Suporta a amplificação de moldes de ADN até 6 kb com tempos de extensão rápidos de 15–30 s/kb.
- Requer uma otimização mínima da PCR e permite a preparação da reação à temperatura ambiente.
- A ADN polimerase Hot-start NeoTaq II carece de atividade exonuclease 3′→5′ (correção de provas).
- Gera produtos de PCR com saliências A em 3′, adequados para clonagem TA com kits de clonagem por PCR.
Condições de armazenamento e preparação de reagentes
Este produto deve ser armazenado a -85 °C a -15 °C num congelador sem ciclos de descongelação para garantir o prazo de validade máximo. O produto permanecerá estável até à data de validade se armazenado conforme especificado.
Ensaio de controlo de qualidade
Pureza
A pureza da ADN polimerase Hot-start NeoTaq II é > 90%, avaliada por eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS seguida de Coloração com Azul de Coomassie.
Contaminação de ADN genómico
O produto deve cumprir os padrões internos de contaminação por ADN, conforme avaliado através de qPCR em tempo real.
Ensaios de nucleases
0,2-0,3 μg de ADN plasmídico são incubados com 5 U de ADN polimerase Hot-start NeoTaq II, em Tampão de Reação 1×, durante 14-16 horas a 37 °C. Após a incubação, o ADN é visualizado num gel de agarose corado com corante Safe DNA Gel Stain. Não deve haver cortes ou entalhes visíveis no ácido nucleico. Testes semelhantes são realizados com o tampão Hot-start NeoTaq II e a solução de MgCl2.
Ensaio funcional
A ADN polimerase Hot-start NeoTaq II é extensivamente testada quanto ao desempenho numa reação em cadeia da polimerase (PCR) de fragmentos de ADN de diferentes tamanhos (1 e 2,5 kb) de ADN genómico humano. Os produtos de PCR resultantes são visualizados como bandas únicas num gel de agarose corado com Safe DNA Gel Stain. Testes funcionais semelhantes são realizados com o tampão Hot-start NeoTaq II e a solução de MgCl2.
Resolução de problemas
Ausência de amplificação do produto ou baixo rendimento
• Temperatura de emparelhamento inadequada
A composição da mistura de reação pode afetar as propriedades de fusão dos primers e do ADN. Ajuste a temperatura de emparelhamento para acomodar o primer com a temperatura de fusão mais baixa (5 °C a 10 °C abaixo da Tm).
• Presença de inibidores da PCR
Alguns procedimentos de isolamento de ADN, particularmente o isolamento de ADN genómico, podem resultar na copurificação de inibidores da PCR. Reduza o volume de ADN molde na reação ou dilua o ADN molde antes de o adicionar à reação. Foi demonstrado que a diluição de amostras até 1:10.000 é eficaz para melhorar os resultados, dependendo da concentração inicial de ADN.
• Aditivos necessários
A adição de agentes potenciadores da PCR (Solução Optimizer 5× ou Solução GC-Enhancer 2×) pode melhorar o rendimento, permitindo simultaneamente a amplificação de moldes difíceis.
Presença de bandas não específicas
• Emparelhamento não específico de primers
Ajuste as condições de emparelhamento e/ou desenhe outro conjunto de primers, aumentando o comprimento e evitando sequências complementares.
• A concentração de Mg2+ é demasiado alta
Geralmente, 1,5-3 mM de MgCl2, tipicamente 2,5 mM de concentração final, funciona bem para a maioria das reações de PCR. A concentração ideal depende do molde-alvo, do tampão e dos dNTPs. Otimize a concentração de magnésio suplementando com MgCl2 em incrementos de 0,5 até 4 mM.