NeoProof DNA polimerase

Componentes e armazenamento de produtos

• Fornecido com um Tampão de Reação 10× e uma Solução Estabilizadora 5×
• Armazenamento recomendado a -20 °C num congelador a temperatura constante
• Estabilidade até ao prazo de validade se armazenado conforme especificado
• Definição da unidade: incorporação de 10 nmoles de dNTPs em 30 minutos a 72 °C

Protocolo PCR

• Protocolo padrão fornecido como orientação geral para a amplificação por PCR
• Orientações para a preparação da reação, incluindo a ordem dos componentes e a montagem em gelo
• Parâmetros de ciclo para desnaturação, recozimento e extensão
• Eletroforese em gel para análise de produtos PCR

Considerações sobre a conceção da PCR

• Conceção de primers de PCR com comprimento adequado (15-30 bases)
• Recomendações para sequências de primers para melhorar o rendimento da PCR e evitar a degradação
• Directrizes para o conteúdo GC do iniciador e para evitar a estrutura secundária interna
• Recomendações para evitar a formação de dímeros de iniciadores e o recozimento não específico dos iniciadores
• Importância de temperaturas de fusão (Tm) semelhantes para ambos os primers

Modelo de ADN 

• Quantidades recomendadas de material de partida com base na qualidade e complexidade
• Orientações para a utilização de modelos de ADN genómico e de modelos de reação de síntese de cADN
• Atenção para não exceder 10% do volume final da reação de PCR para modelos de cDNA

Concentração de enzimas

• Concentração enzimática recomendada de 1,25 U (0,5 μL) numa reação de 50 μL
• Volumes de enzima mais elevados (até 2,5 U) para amplificar modelos abundantes (>50 ng de gDNA)
• Opções de diluição para maior comodidade durante a montagem da PCR

Ensaios de controlo de qualidade

• Avaliação da pureza através de SDS-PAGE e coloração com Coomassie Blue
• Avaliação da contaminação do ADN genómico através de PCR
• Ensaios com nuclease para verificar a existência de nicking ou corte de ácidos nucleicos
• Ensaio funcional utilizando fragmentos de ADN de diferentes tamanhos a partir de ADN genómico humano