Mistura-mestre NeoTaq II
Descrição
- NeoTaq II Master Mix: mistura pronta a usar para PCR padrão robusta e fiável.
- Contém ADN polimerase, dNTPs, tampão de reação e aditivos optimizados.
- Suporta a amplificação de moldes de ADN até 6 kb.
- MgCl₂ a 2,5 mM que permite protocolos de PCR flexíveis.
- Os corantes de rastreio azul e amarelo permitem o carregamento directo em géis de agarose.
- Sem actividade exonucleásica 3′→5′; produz extremos salientes A adequados para clonagem TA.
- Para aplicações a jusante baseadas em fluorescência ou absorbância, purifique primeiro os produtos de PCR ou utilize a versão sem corante.
Condições de Armazenamento
Esta master mix deve ser armazenada a -85 °C a -15 °C num congelador sem ciclos de descongelação para garantir o prazo de validade máximo. A elevada estabilidade térmica da mistura de enzimas permite-lhe permanecer estável a 4 °C ou mesmo à temperatura ambiente durante um máximo de 4 semanas. O produto permanecerá estável até à data de validade se armazenado conforme especificado.
Ensaios de controlo de qualidade
Pureza
A pureza da ADN polimerase NeoTaq II é >90% avaliada por eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS seguida de coloração com Azul de Coomassie.
Contaminação por ADN genómico
O produto deve estar isento de qualquer contaminação por ADN detectável, conforme avaliado por PCR. Por conseguinte, é adequado para a amplificação de ADN bacteriano e fúngico com base em ensaios de PCR de rRNA 16S e 18S.
Ensaios de nucleases
0,2-0,3 μg de ADN plasmídico são incubados com a NeoTaq II Master mix durante 14-16 horas a 37 °C. Após a incubação, o ADN é visualizado num gel de agarose corado com Safe DNA Gel Stain. Não devem existir cortes ou entalhes visíveis no ácido nucleico.
Ensaio funcional
A NeoTaq II Master mix é testada quanto ao desempenho numa reação em cadeia da polimerase (PCR) para a amplificação de fragmentos de ADN de diferentes tamanhos (1 e 2,5 kb) a partir de ADN genómico humano. Os produtos de PCR resultantes são visualizados como bandas únicas num gel de agarose corado com Safe DNA Gel Stain.
Resolução de problemas
Sem amplificação do produto ou baixo rendimento
Temperatura de emparelhamento inadequada
A composição da mistura de reação pode afectar as propriedades de fusão dos primers e do ADN. Ajuste a temperatura de emparelhamento para acomodar o primer com a temperatura de fusão mais baixa (5 °C a 10 °C abaixo da Tm).
Presença de inibidores de PCR
Alguns procedimentos de isolamento de ADN, particularmente o isolamento de ADN genómico, podem resultar na co-purificação de inibidores de PCR. Reduza o volume de ADN molde na reação ou dilua o ADN molde antes de o adicionar à reação. Demonstrou-se que a diluição de amostras mesmo a 1:10.000 é eficaz para melhorar os resultados, dependendo da concentração inicial de ADN.
A concentração de Mg2+ é demasiado baixa
O Mg2+ está incluído na Master Mix a uma concentração final de 2,5 mM, o que é suficiente para a maioria dos alvos. Para alguns alvos, poderá ser necessária uma concentração de Mg2+ mais elevada. Titular de 2,5 mM a 4 mM (concentração final) em incrementos de 0,5 mM. (Nota: O MgCl2 não é fornecido em tubos separados).
Presença de bandas não específicas
Emparelhamento não específico de primers
Ajuste as condições de emparelhamento e/ou desenhe outro conjunto de primers, aumentando o comprimento e evitando sequências complementares.