Introduction

L'avènement du Séquençage de Nouvelle Génération (NGS) a fondamentalement transformé la génomique, le diagnostic clinique et la recherche en sciences de la vie. En permettant le séquençage parallèle de millions de fragments d'ADN, le NGS offre une puissance sans précédent pour des applications allant du séquençage du génome entier et de la transcriptomique à l'épigénétique et la métagénomique (Goodwin et al., 2016; Head et al., 2014). Cependant, la qualité des résultats de séquençage dépend de manière critique du processus de préparation de la banque — la série d'étapes de biologie moléculaire qui convertit les acides nucléiques extraits en un format prêt pour le séquençage (Endrullat et al., 2016; Illumina, 2017).

L'ADN ou l'ARN bruts ne peuvent pas être chargés directement sur un séquenceur NGS. Ils doivent plutôt être convertis en une banque de séquençage, une collection de fragments d'ADN flanqués de séquences adaptatrices spécifiques à la plateforme qui permettent la génération de clusters, l'hybridation des amorces de séquençage et l'identification des échantillons (Gargise et al., 2012). Les erreurs introduites lors de la préparation de la banque peuvent compromettre l'ensemble de l'expérience : une mauvaise qualité d'échantillon, des réactions enzymatiques inefficaces ou un enrichissement inégal peuvent introduire des biais, réduire la couverture ou diminuer la sensibilité de l'analyse en aval (van Dijk et al., 2018; Jones et al., 2015). Dans des contextes cliniques ou diagnostiques, ces problèmes peuvent avoir des conséquences particulièrement graves.

Ce protocole complet fournit un flux de travail détaillé, étape par étape, pour la préparation de banques pour le NGS, en mettant l'accent sur les plateformes compatibles Illumina. Chaque étape est expliquée avec ses principes sous-jacents, des considérations pratiques et des stratégies d'optimisation pour aider les chercheurs à obtenir des résultats reproductibles et de haute qualité (Metzker, 2010; Quail et al., 2008; Aird et al., 2011).

1. Le Cadre Conceptuel : Du Rouleau Biologique aux Pages Lisibles

Pour comprendre la préparation de banque, il est utile de considérer un génome comme un rouleau de texte incroyablement long, un chromosome contenant des millions de paires de bases qui ne peut être lu d'un bout à l'autre par un séquenceur. Un séquenceur ne peut lire que de courts segments d'ADN à la fois. L'objectif de la préparation de banque est de transformer cet immense rouleau continu en une « banque » de fragments gérables que le séquenceur peut lire.

Cette transformation implique quatre opérations fondamentales :

1. Fragmentation : Rupture de l'ADN long en morceaux plus petits.

2. Réparation des extrémités : Conversion des extrémités irrégulières des fragments en un format uniforme adapté à la fixation des adaptateurs.

3. Fixation des adaptateurs : Ajout de séquences universelles permettant le séquençage et l'identification des échantillons.

4. Amplification : Création de copies suffisantes de chaque fragment pour la détection.

Chacune de ces opérations doit être réalisée avec précision pour garantir que la banque finale représente fidèlement l'échantillon d'origine.

2. L'Importance de la Complexité de la Banque

Un concept clé dans la préparation de banque est la complexité de la banque, c'-à-dire le nombre de fragments d'ADN uniques présents dans la banque. Une banque idéale doit refléter le matériel de départ aussi fidèlement que possible, chaque fragment original étant représenté une fois. Les réductions de complexité résultent généralement de l'amplification par PCR, qui augmente le nombre de lectures dupliquées. Des taux élevés de duplication par PCR indiquent que la préparation de la banque doit être modifiée, nécessitant généralement une amélioration de la complexité de la banque.

Extraction des Acides Nucléiques et Évaluation de la Qualité

1. Principe

La première étape de tout protocole de préparation d'échantillons est l'extraction des acides nucléiques (ADN ou ARN) à partir d'échantillons biologiques tels que le sang, les cellules en culture, les coupes de tissus ou l'urine. La qualité de l'acide nucléique extrait détermine directement le succès de la préparation de la banque et du séquençage ultérieur. Les acides nucléiques dégradés ou contaminés peuvent introduire des biais, réduire la couverture et compromettre la qualité des données.

2. Protocole

2.1. Extraction d'ADN

1. Extraire l'ADN génomique en utilisant une méthode validée et appropriée au type d'échantillon :

   • Tissu frais congelé : Extraction au phénol-chloroforme, kits sur colonne de silice ou méthodes basées sur des billes magnétiques.

   • Tissu FFPE : Kits spécialisés conçus pour l'ADN dégradé (par exemple, kit ADN pour tissu FFPE), incluant souvent des étapes pour inverser les liaisons au formol.

   • Sang : Kits tels que le QIAamp DNA Blood Mini Kit ou méthodes de précipitation au sel.

   • cfADN/ctADN : Kits spécialisés avec des conditions de liaison optimisées pour les petits fragments.

2. Pour le séquençage de l'ARN, l'extraction de l'ARN doit préserver son intégrité :

   • Extraire l'ARN immédiatement après le prélèvement pour réduire l'activité des RNases cellulaires.

   • Si un stockage temporaire est nécessaire, conserver les échantillons dans une solution de stabilisation.

   • Utiliser des embouts filtrants stériles tout au long de la procédure pour minimiser la contamination par les RNases.

   • Conserver l'ARN purifié sur glace pendant son utilisation et le stocker à -80 °C en aliquotes pour réduire les cycles de congélation-décongélation.

2.2. Évaluation de la Qualité

1. Mesure de la concentration : Utiliser des méthodes fluorométriques, et non des mesures d'absorbance (Nanodrop), qui sont sensibles à la contamination par les nucléotides libres et d'autres composés.

2. Évaluation de la pureté : Évaluer par spectrophotométrie UV-Vis :

   • Rapport A260/A280 idéal : ~2,0 pour l'ARN, 1,8-2,0 pour l'ADN.

   • Rapport A260/A230 idéal : 2,0-2,2.

   • Les écarts indiquent une contamination par le phénol, les sels chaotropiques ou les protéines.

3. Évaluation de l'intégrité : Pour l'ADN, évaluer par électrophorèse sur gel d'agarose ou électrophorèse capillaire. Pour l'ARN, déterminer le RNA Integrity Number (RIN) ou le RNA Quality Number (RQN). Un ARN de haute qualité montre deux bandes proéminentes représentant les ARNr 18S et 28S ; un étalement indique une dégradation.

4. Critères d'acceptation : Les échantillons doivent répondre aux exigences seuils ; les échantillons échouant au contrôle qualité peuvent être traités aux risques de l'utilisateur, mais cela peut conduire à un rendement de banque insuffisant et à une distribution inégale des lectures.

Fragmentation de l'ADN

1. Principe

La fragmentation est le processus de rupture des longs brins d'ADN en morceaux plus petits adaptés au séquençage. La taille optimale des fragments dépend de la plateforme de séquençage et de l'application, généralement 200 à 600 pb pour les plateformes Illumina. Cette étape est critique car les fragments trop longs ne peuvent pas subir d'amplification en pont sur la flow cell, tandis que les fragments trop courts peuvent contenir une information de séquence unique insuffisante.

2. Méthodes

2.1. Fragmentation Mécanique (Cisaillement Acoustique)

Le cisaillement mécanique utilise une énergie acoustique à haute fréquence pour rompre les molécules d'ADN par des forces de cavitation.

• Avantages : Produit des fragments avec une distribution aléatoire et un biais de séquence minimal, considéré comme la méthode de référence.

• Inconvénients : Nécessite un équipement spécialisé ; peut nécessiter une sélection par taille supplémentaire.

• Mécanisme : Les forces physiques cassent l'ADN indépendamment du contexte de séquence, produisant des fragments aux extrémités irrégulières qui nécessitent un polissage enzymatique ultérieur.

2.2. Fragmentation Enzymatique

Les méthodes enzymatiques utilisent des endonucléases non spécifiques de séquence (par exemple, la Fragmentase) qui génèrent des fragments d'ADN par une activité enzymatique contrôlée.

• Avantages : Ne nécessite pas d'instrumentation spécialisée ; peut être combinée avec d'autres étapes de la préparation de banque.

• Inconvénients : Peut introduire un certain biais de séquence en raison des préférences enzymatiques.

• Approche de tagmentation : Une enzyme transposase (par exemple, Tn5) fragmente simultanément l'ADN et attache des séquences adaptatrices en une seule réaction. Ceci est très efficace mais la transposase a des préférences de séquence, introduisant potentiellement un biais où certaines régions sont sur- ou sous-représentées.

2.3. Protocole

1. Fragmentation mécanique : Définir les paramètres selon les recommandations du fabricant de l'instrument en fonction de la taille de fragment cible. Par exemple :

   • Volume d'ADN d'entrée : Généralement 50-100 µL.

   • Ajuster le facteur d'utilisation, l'intensité et les cycles par rafale pour obtenir la taille de fragment désirée.

   • Confirmer la distribution de taille en analysant au Bioanalyzer.

2. Fragmentation enzymatique : Utiliser des mélanges enzymatiques spécialisés :

   • Combiner l'ADN fragmenté avec le mélange d'enzymes de fragmentation.

   • Incuber à 37 °C pendant la durée spécifiée (généralement 5 à 30 minutes).

   • Inactiver les enzymes par chauffage à 65 °C pendant 10 à 20 minutes.

Addition de dA (A-Tailing)

1. Principe

L'A-tailing ajoute un seul nucléotide adénine (A) aux extrémités 3' des fragments d'ADN à bouts francs. Cela crée une extrémité sortante complémentaire de l'extrémité sortante simple thymine (T) présente sur les adaptateurs Illumina.

La logique biochimique de l'A-tailing est élégante :

1. Empêche la ligation fragment-fragment : Deux extrémités A-tailing ne sont pas complémentaires l'une de l'autre, empêchant la formation de concatémères.

2. Permet une ligation efficace des adaptateurs : Les extrémités « collantes » courtes des fragments A-tailing et des adaptateurs à queue T s'hybrident, augmentant considérablement l'efficacité de la ligation.

La réaction est réalisée en utilisant une ADN polymérase qui ajoute une adénine non matricée à l'extrémité 3'.

2. Protocole

2.1. Protocole Standard d'A-Tailing :

1. Ajouter le mélange maître d'A-tailing à la réaction de réparation des extrémités :

   • Taq ADN polymérase (ou fragment de Klenow dépourvu d'activité exonucléase 3'→5').

   • dATP (nucléotide unique, pas des dNTPs).

   • Tampon d'A-tailing.

2. Incuber à 37 °C pendant 30 minutes.

3. Inactiver par chauffage à 65 °C pendant 20 minutes.

Protocole Combiné ER/A (recommandé) :

• De nombreux kits commerciaux combinent les deux réactions en un seul module « End Repair/dA-Tailing ».

• Réaction typique : 15 minutes à 20 °C, suivies de 15 minutes à 65 °C.

Ligation des Adaptateurs

1. Principe

La ligation des adaptateurs attache des séquences adaptatrices spécifiques à la plateforme aux fragments d'ADN A-tailing. Les adaptateurs sont de courts oligonucléotides synthétiques qui remplissent deux fonctions essentielles :

1. Liaison à la flow cell : Ils contiennent des séquences complémentaires des oligonucléotides fixés à la surface de la flow cell du séquenceur, ancrant les fragments pour la génération de clusters.

2. Sites universels d'amorçage : Ils fournissent des séquences standardisées pour la liaison de l'amorce de séquençage et de l'ADN polymérase.

Les adaptateurs sont conçus avec une extrémité sortante T complémentaire de la queue A des fragments d'ADN, permettant une ligation très efficace.

2. Structure des Adaptateurs (Adaptateurs en Y Illumina)

• Séquences P5/P7 : Permettent la liaison à la flow cell.

• Séquences index (codes-barres) : Séquences uniques qui identifient les échantillons individuels, permettant le multiplexage.

• Sites de liaison Rd1/Rd2 : Sites d'hybridation des amorces pour le séquençage.

• Extrémité sortante T : Complémentaire de la queue A des fragments d'ADN.

3. Multiplexage et Indexation

Le multiplexage est l'un des concepts les plus puissants du séquençage moderne. Lors de la préparation de la banque, différents échantillons reçoivent des adaptateurs contenant des séquences index uniques (« étiquettes nominatives » moléculaires). Toutes les banques sont regroupées (pooling) et séquencées simultanément. À l'étape d'analyse des données, le logiciel de démultiplexage lit le code-barres de chaque séquence et l'assigne au bon échantillon.

4. Protocole

1. Préparer la réaction de ligation :

   • Fragments d'ADN A-tailing.

   • Adaptateurs (avec des index uniques pour le multiplexage).

   • ADN ligase T4.

   • Tampon de ligation (contient de l'ATP comme cofacteur).

   • PEG (polyéthylène glycol) pour améliorer l'efficacité de la ligation.

2. Le rapport optimal adaptateur:insert est d'environ 10 adaptateurs pour 1 fragment. Trop d'adaptateurs entraînent la formation de dimères d'adaptateurs ; trop peu réduisent l'efficacité de la ligation.

3. Incuber à 20 °C pendant 15 à 30 min. Les ligations à température ambiante se déroulent généralement plus rapidement qu'à 16 °C pendant la nuit.

4. Inactiver par chauffage à 65 °C pendant 10 min.

5. Procéder à la sélection par taille et à la purification.

Sélection par Taille et Purification

1. Principe

Après la ligation des adaptateurs, la réaction contient un mélange de produits désirés (fragments d'ADN avec adaptateurs) et de composants indésirables :

• Adaptateurs non ligaturés : Entrent en compétition pour les sites de liaison pendant le séquençage.

• Dimères d'adaptateurs : Adaptateurs ligaturés entre eux, qui sont de petits fragments consommant la capacité de séquençage.

• Fragments hors de la gamme de taille souhaitée : Peuvent réduire l'efficacité du séquençage et la qualité des données.

La sélection par taille élimine les fragments hors de la gamme de taille cible et supprime les dimères d'adaptateurs. La taille optimale de l'insert de la banque dépend de l'application de séquençage : les protocoles Illumina typiques ciblent des tailles d'insert de 350 pb ou 550 pb.

2. Sélection par Taille Basée sur des Billes Magnétiques (Technologie SPRI)

La méthode la plus courante de sélection par taille utilise des billes carboxylées paramagnétiques (par exemple, COOH MagneZoom) dans un processus appelé Immobilisation Réversible en Phase Solide (SPRI).

Principe : L'ADN se lie aux billes paramagnétiques en présence de PEG et de sel. L'affinité de liaison dépend de la taille du fragment et du rapport bille/échantillon.

• Les fragments plus petits nécessitent des concentrations plus élevées de PEG et de sel pour se lier.

• Les fragments plus grands se lient préférentiellement à des concentrations de billes plus faibles.

• Les fragments non liés restent en solution et sont éliminés avec le surnageant.

Stratégies de Sélection par Taille :

Stratégie	Objectif	Ratios de Billes
Sélection côté gauche	Élimine les petits fragments (<200 pb)	Utiliser les billes pour lier les fragments désirés ; retirer le surnageant.
Sélection côté droit	Élimine les grands fragments (>600 pb)	Les fragments désirés restent dans le surnageant ; retirer les billes.
Sélection double face (double)	Enrichit pour une fenêtre de taille spécifique (par ex., 300-500 pb)	Éliminer les petits fragments (côté gauche), puis éliminer les grands fragments (côté droit).

3. Protocole

Purification simple face (élimine les petits fragments) :

1. Ajouter des billes magnétiques au produit de ligation au rapport recommandé (généralement 0,7-1,0x le volume de l'échantillon).

2. Incuber à température ambiante pendant 5 à 15 min.

3. Placer sur un support magnétique jusqu'à ce que la solution s'éclaircisse (2 à 5 minutes).

4. Retirer soigneusement le surnageant.

5. Laver les billes deux fois avec de l'éthanol à 80 %, 30 secondes chacun.

6. Sécher à l'air pendant 5 à 10 min pour éliminer l'éthanol résiduel.

7. Éluer l'ADN dans du tampon TE à faible teneur en EDTA ou de l'eau exempte de nucléases.

Sélection par Taille Double Face (enrichit une gamme de taille spécifique) :

1. Première sélection (éliminer les petits fragments) :

   • Ajouter des billes à un ratio plus faible (par ex., 0,5x) pour lier les grands fragments.

   • Recueillir le surnageant contenant les fragments désirés et les petits fragments.

2. Deuxième sélection (éliminer les grands fragments) :

   • Ajouter des billes supplémentaires au surnageant (par ex., 0,7x supplémentaire pour un total de 1,2x).

   • Les fragments désirés se lient aux billes ; les petits fragments restent dans le surnageant.

   • Procéder à la capture des billes, au lavage et à l'élution comme ci-dessus.

4. Avantages de la Purification par Billes Magnétiques

• Pas d'électrophorèse sur gel requise : délai d'exécution plus rapide et risque de contamination plus faible.

• Adapté à l'automatisation : évolutif vers les plaques 96 puits et les robots de manipulation de liquides.

• Haute reproductibilité : distributions de taille cohérentes d'un lot à l'autre.

• Récupération typique ≥85 % pour une sélection simple face.

Amplification de la Banque

1. Principe

Après la sélection par taille, la banque contient des fragments d'ADN ligaturés aux adaptateurs, mais la quantité est souvent insuffisante pour le séquençage. L'amplification via PCR crée suffisamment de matériel pour la génération de clusters et la détection.

La PCR utilise des amorces complémentaires des séquences universelles des adaptateurs, permettant une amplification exponentielle de tous les fragments de la banque avec un biais minimal.

2. Considérations Importantes

1. Nombre de cycles : Utiliser le nombre minimum de cycles requis pour générer une banque suffisante (généralement 4 à 12 cycles, selon la quantité d'ADN d'entrée). Une suramplification peut introduire un biais de PCR et réduire la complexité de la banque.

2. Choix de la polymérase : Les polymérases à haute fidélité avec activité de relecture minimisent les erreurs. Cependant, les polymérases ayant une activité exonucléase 3'→5' ne peuvent pas étendre les matrices A-tailing, la queue A étant ajoutée avant l'amplification, ceci ne pose donc pas de problème.

3. Introduction de biais : L'amplification par PCR peut introduire un biais de GC (les régions à haut contenu en GC s'amplifient moins efficacement) et créer des duplicats de PCR qui réduisent la complexité effective de la banque.

3. Protocole

1. Préparer le mélange maître de PCR :

   • ADN purifié ligaturé aux adaptateurs.

   • ADN polymérase à haute fidélité.

   • Amorces PCR (P5 et P7, complémentaires des séquences adaptatrices).

   • dNTPs.

   • Tampon de réaction.

2. Effectuer l'amplification par PCR :

   • Dénaturation initiale : 98 °C pendant 30 à 45 secondes.

   • 4 à 12 cycles de :

     • Dénaturation : 98 °C pendant 10 à 15 secondes.

     • Hybridation : 60-65 °C pendant 20 à 30 secondes.

     • Élongation : 72 °C pendant 30 à 60 secondes (selon la taille du fragment).

   • Élongation finale : 72 °C pendant 1 à 5 min.

   • Maintien à 4 °C.

3. Purifier les banques amplifiées en utilisant des billes magnétiques (comme dans la section 7).

4. Éluer dans un tampon approprié pour les applications en aval.

Contrôle Qualité et Quantification de la Banque

1. Principe

Avant le séquençage, les banques doivent être soigneusement caractérisées pour s'assurer qu'elles répondent aux exigences de qualité et de quantité. Les banques de mauvaise qualité compromettront les résultats du séquençage et gaspilleront la précieuse capacité de la flow cell.

2. Quantification

Quantification Fluorométrique (Qubit) :

• Mesure spécifiquement la concentration d'ADN double brin.

• Les colorants s'intercalent dans l'ADNdb, fournissant une quantification précise.

• Essentiel pour déterminer le rendement de la banque (ng) et la concentration (ng/µL).

Quantification par qPCR (la plus précise pour la concentration molaire) :

• Utilise des amorces spécifiques aux séquences adaptatrices.

• Mesure les molécules amplifiables (uniquement les fragments avec les deux adaptateurs).

• Fournit la concentration la plus précise pour la normalisation et le pooling.

• Crucial pour le séquençage multiplexé où une représentation égale est essentielle.

3. Évaluation de la Qualité

Analyse de la Taille des Fragments :

• L'électrophorèse capillaire fournit un dimensionnement des fragments basé sur la fluorescence.

• Un profil de banque acceptable montre un seul pic à la taille de fragment attendue (insert cible + adaptateurs).

• La contamination par les dimères d'adaptateurs doit être <5 % de la banque totale.

• L'absence de pics visibles ou des distributions larges indiquent des problèmes.

4. Critères d'Acceptation

Paramètre	Plage Acceptable
Concentration d'ADN	Cohérente avec l'entrée, >2 ng/µL après purification
Taille des fragments	Pic unique, taille attendue ±50 pb
Contamination par dimères d'adaptateurs	<5% de la banque totale
Rendement de la banque	≥50 ng (varie selon la plateforme)
Concentration molaire	≥1 nM pour Illumina

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Normalisation et Pooling des Banques

1. Principe

Pour le séquençage multiplexé, plusieurs banques indexées sont mélangées (pooling) et séquencées simultanément. Un pooling précis exige que chaque banque soit présente à la concentration molaire appropriée. Un pooling inégal entraîne un nombre variable de lectures par échantillon, certains échantillons étant sur- ou sous-représentés.

2. Protocole

1. Calculer la concentration molaire de chaque banque en utilisant la formule :

   • Molarité (nM) = (Concentration en ng/µL × 10^{^6}) / (Taille du fragment en pb × 660)

2. Déterminer le volume requis de chaque banque pour le pooling en fonction de la concentration molaire cible (généralement 1 à 4 nM pour Illumina).

3. Préparer le pool de banques à la concentration recommandée par la plateforme de séquençage.

4. Vérifier la qualité et la concentration du pool de banques avant la dénaturation et le chargement.

Applications Spécialisées

1. ADN de Faible Quantité (Low-Input)

Pour les échantillons avec un matériel de départ limité (<500 ng pour les protocoles standard) ou de l'ADN dégradé (FFPE, ADNlc), des approches spécialisées sont requises.

Stratégies :

• Utiliser des kits de préparation de banque spécialisés conçus pour les faibles quantités d'entrée.

• Approches de ligation simple brin pour l'ADN fortement endommagé.

• Réduire les cycles d'amplification pour minimiser le biais de PCR tout en équilibrant avec un rendement suffisant.

• Pour les échantillons en dessous des critères d'entrée, le rendement de la banque peut être insuffisant et les résultats doivent être interprétés avec prudence.

2. Échantillons FFPE

Les échantillons fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) présentent des défis en raison de :

• La dégradation de l'ADN (fragmentation).

• La modification chimique (liaisons au formol).

• Des rendements faibles.

Recommandations :

• Utiliser des kits d'extraction spécialisés pour FFPE.

• Envisager des approches de préparation de banque simple brin.

• S'attendre à une complexité de banque plus faible et à des taux de duplication plus élevés.

• Tous les protocoles ne sont pas compatibles FFPE ; vérifier avant de commencer.

3. Séquençage d'ARN

Les banques de RNA-Seq nécessitent des étapes supplémentaires pour convertir l'ARN en ADNc avant la préparation standard de la banque d'ADN.

Aperçu du Protocole :

1. Fragmentation de l'ARN : Fragmenter l'ARN (généralement chimiquement ou enzymatiquement).

2. Synthèse du premier brin d'ADNc : Rétrotranscrire l'ARNm en utilisant des amorces aléatoires (hexamères aléatoires) ou oligo(dT).

3. Synthèse du second brin d'ADNc : La RNase H crée des coupures dans l'ARN, créant des amorces pour que l'ADN polymérase synthétise le second brin.

4. Réparation des extrémités/A-tailing : Comme pour les banques d'ADN.

5. Ligation des adaptateurs : Comme pour les banques d'ADN.

6. Amplification et CQ : Comme pour les banques d'ADN.

Considérations Spéciales :

• En cas d'utilisation de la sélection poly(A), assurer une élimination efficace de l'ARN ribosomal.

• Les banques spécifiques au brin nécessitent des protocoles spécialisés.

4. Séquençage Bisulfite du Génome Entier (WGBS)

Pour les études de méthylation de l'ADN, la conversion au bisulfite doit être effectuée après la ligation des adaptateurs.

Modifications du Protocole :

1. Effectuer la réparation des extrémités, l'A-tailing et la ligation des adaptateurs.

2. Conversion au bisulfite : Convertir les cytosines non méthylées en uracile.

3. Effectuer l'amplification de la banque (avec précaution car l'ADN traité au bisulfite est très fragmenté).

4. Les cytosines méthylées sont protégées de la conversion et identifiées comme des cytosines lors du séquençage.

Caractéristiques Clés :

• Fournit une cartographie de la méthylation à résolution d'une seule base.

• Peut être réalisé sans kits commerciaux en utilisant des réactifs auto-préparés et des systèmes d'index personnalisables.

• Flexible et rentable pour les applications à haut débit.

5. Séquençage Ciblé

Pour de nombreuses applications, le séquençage du génome entier est inutile ou trop coûteux. Le séquençage ciblé enrichit des régions génomiques d'intérêt spécifiques.

Capture par Hybridation (en solution) :

1. Préparer une banque standard (jusqu'à la ligation des adaptateurs).

2. Hybrider les banques avec des sondes biotinylées complémentaires des régions cibles.

3. Capturer avec des billes enrobées de streptavidine.

4. Laver pour éliminer les fragments non ciblés.

5. Éluer les cibles enrichies pour le séquençage.

Basé sur les amplicons :

1. Utiliser une PCR multiplex avec des amorces qui incorporent des séquences adaptatrices.

2. Amplifier directement les régions cibles.

3. Procéder à la préparation de banque standard.

6. Automatisation

Pour les applications cliniques ou à haut débit, la préparation des banques peut être automatisée pour améliorer la reproductibilité et réduire le risque de contamination.

Avantages :

• Réduction du temps de manipulation et augmentation de la productivité.

• Résultats cohérents d'un lot à l'autre.

• Minimisation de l'erreur humaine et de la contamination.

Approches :

• Manipulateurs de liquides avec modules magnétiques pour la purification sur billes.

• Plateformes microfluidiques pour la préparation intégrée des échantillons.

• Programmes de pipetage prédéfinis pour un fonctionnement sans intervention manuelle.

Guide de Dépannage

Problème	Cause Possible	Solution
Faible rendement de la banque	ADN de départ insuffisant	Augmenter l'ADN de départ dans la plage recommandée.
	Ligation inefficace	Vérifier le rapport adaptateur/insert ; s'assurer de la présence d'ATP dans le tampon de ligation.
	Sur-purification	Optimiser le ratio de billes ; réduire les étapes de lavage.
	Amplification inefficace	Augmenter les cycles de PCR (mais sans excès).
Contamination par dimères d'adaptateurs	Excès d'adaptateurs	Optimiser le rapport adaptateur/insert.
	Purification inefficace	Effectuer une sélection par taille double face ; s'assurer que l'étape de lavage des billes capture les dimères.
Distribution large de la taille des fragments	Fragmentation inefficace	Vérifier les paramètres de sonication ; évaluer la qualité de l'entrée.
	ADN de départ dégradé	Évaluer l'intégrité de l'ADN avant de commencer ; envisager des protocoles spécialisés.
Duplicats de PCR élevés	Cycles d'amplification excessifs	Réduire les cycles de PCR ; augmenter l'ADN de départ.
	Faible complexité de l'entrée	Envisager de réduire l'amplification ; utiliser un nombre de cycles inférieur.
Faible qualité de séquençage	Réparation des extrémités incomplète	Vérifier l'activité enzymatique ; s'assurer d'une incubation appropriée.
	Sélection par taille sous-optimale	Vérifier le rapport bille/échantillon ; confirmer la taille d'insert cible.
Biais de GC	Biais de PCR	Utiliser des polymérases à haute fidélité avec un biais de GC minimal ; réduire le nombre de cycles.
	Biais de fragmentation	Envisager le cisaillement mécanique plutôt que les méthodes enzymatiques.
Fragments chimériques	A-tailing inefficace	Assurer des conditions d'A-tailing appropriées ; vérifier la concentration en dATP.
	Ligation d'adaptateur inefficace	Vérifier l'activité de la ligase ; optimiser le temps de réaction.

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Sources Courantes d'Artéfacts et de Biais

1. Duplicats de PCR

Les duplicats de PCR se produisent lorsque plusieurs copies du même fragment sont amplifiées, conduisant à une surreprésentation de certaines séquences. Des taux de duplication élevés réduisent la couverture effective et peuvent fausser les analyses quantitatives.

Atténuation : Minimiser les cycles de PCR ; augmenter l'ADN de départ ; utiliser des identifiants moléculaires uniques (UMI).

2. Biais de GC

Les régions à haut contenu en GC s'amplifient moins efficacement pendant la PCR, conduisant à une sous-représentation. Les régions riches en GC peuvent également se fragmenter moins efficacement.

Atténuation : Utiliser des enzymes de PCR optimisées pour les matrices riches en GC ; envisager des méthodes d'amplification alternatives.

3. Dimères d'Adaptateurs

Les dimères d'adaptateurs se forment lorsque deux adaptateurs se liguent sans insert. Ces petits fragments consomment la capacité de séquençage et réduisent la qualité des données.

Atténuation : Optimiser le rapport adaptateur/insert ; effectuer une sélection par taille efficace ; utiliser des méthodes qui éliminent les petits fragments.

4. Biais de Séquence dans la Tagmentation

Les méthodes basées sur la transposase (tagmentation) ont des préférences de séquence, provoquant potentiellement une sur- ou sous-représentation de certaines régions génomiques.

Atténuation : Envisager le cisaillement mécanique pour les applications nécessitant une représentation non biaisée ; optimiser les conditions de tagmentation.

5. Fragments Chimériques

Les fragments chimériques se forment lorsque différents fragments d'ADN se liguent ensemble, créant des séquences qui n'existent pas dans le génome d'origine.

Atténuation : Un A-tailing efficace empêche la formation de concatémères ; utiliser la suppression d'artéfacts spécifiques au brin dans l'analyse des données.

Références

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2. Metzker, M. L. (2010). Sequencing technologies — the next generation. Nature Reviews Genetics, 11(1), 31–46.

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