Protocole universel de PCR quantitative (qPCR) avec SYBR Green
Protocole KAPA™ SYBR® FAST qPCR Master Mix (2X) Universal
Réactifs :
- Matrice ADN
- Amorce sens
- Amorce antisens
- Master Mix (2X)
- Eau de qualité PCR
Protocole général de qPCR
Etape 1: Réaction d'installation de la qPCR
- Avant la préparation des réactions de qPCR reactions, bien mélanger l'ADN matrice, les amorces et les sondes.
- Calculer les volumes requis de chaque composant selon le tableau suivant:
| Concentration finale | 20μl rxn | |
| Eau de qualité PCR jusqu'à 20μl | Selon besoins | |
| Master Mix (2X) qPCR | 1X | 10μl |
| Amorce sens (10μM) | 200 nM | 0.4μl |
| Amorce antisens (10μM) | 200 nM | 0.4μl |
| Matrice ADN | (<20 ng/20μl rxn) | Variable |
| ROX élevé/bas (optionnel) | 0.4μl |
Etape 2: Configuration de la plaque
- Transférer le volume approprié de mélange réactionnel dans chaque puits d'une plaque ou sans un tube de PCR. Les volumes réactionnels peuvent être réduits de 20μl à 10μl si des tubes/plaques de faible volume sont utilisés.
- Couvrir ou sceller le tube/la plaque de réaction et centrifuger brièvement.
Etape 3: Exécution de la réaction qPCR
- Si possible, sélectionner le mode rapide sur l'instrument.
- Programmer le protocole suivant:
- Activation enzymatique à 95 °C pendant 20 sec - 3 min (1 cycle)
- Dénaturer à 95 °C pendant 1 - 3 sec
- Appariement/Elongation/Acquisition à 60 ºC moins de 20 sec
- Dissociation selon les instructions de l'appareil
Etape 4: Analyse des résultats
- L'analyse des données varie en fonction de l'instrument utilisé. Se référer à votre guide de l'utilisateur de l'instrument.
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