Protocole général de qPCR pour le séquençage NGS

Protocole KAPA HiFi™ Library Amplification Kit

Protocole d'amplification de banque

Etape 1: Préparation
- Décongeler les amorces nécessaire à la PCR (voir Tableau 1 pour les détails) et le tube de KAPA HiFi HotStart Real-Time PCR Master Mix (2X) et les fluorescents standards 1-4 à température ambiante.
- Mélanger et centrifuger brièvement le KPA HiFi HotStart Real-Time PCR Master Mix (2X) décongelé, l'amorce et les fluorescents standards 1-4 pendant 5 secondes à 600 x g.
- Décongeler et centriguger brièvement l'adaptateur ligaturé, la banque ADN purifié séparé selon la taille pendant 5 secondes à 600 x g.
- Pré-programmer le thermocycleur en utilisant le protocole de cycle recommandé fourni dans le Tableau 1 pour l'amplification de l'ensemble de la banque d'amorces PCR.

Etape 2: Installation de la réaction
Chaque plaque doit comporter un ensemble de fluorescents standards 1 - 4. (chargés chacun en trois exemplaires) en plus d'un seul mélange réactionnel de PCR en temps réel de 50 µl pour chaque banque nécessitant une amplification
Afin de maintenir la diversité des banques optimale, il est nécessaire d'ajouter suffisamment d'adaptateur ligaturé à la banque d'ADN à chaque réaction d'enrichissement par PCR. Le nombre de cycles optimaux dépend du volume et de la concentration du matériel de banque ajouté à chaque 50 µl de réaction de PCR. Une fluorescence de fond élevée peut résulter si >100 ng de matrice ADN double brin est ajoutée par 50 µl de mélange réactionnel de PCR en temps réel. .
Pour chaque réaction, ajouter les composés suivants en changeant de cônes après chaque étape de pipetage. Consulter le tableau 1 pour le montage réactionnel proposé pour la préparations de protocoles spécifiques de la banque.

2.1: Installation de l'échantillon

• 25μL de KAPA HiFi HotStart Real-Time PCR Master Mix (2X)
• Mélange d'amorces ou chaque amorce individuellement
• Adaptateur ligaturé purifié de la banque ADN
• Ajuster à 50μL avec l'eau pour PCR

2.2: Installation de fluorescents standards

• Ajouter 50μL de chaque of each fluorescent standard in triplicate to wells of the real-time PCR plate
• Sceller chaque mélange réactionnel, mélanger légèrement et centrifuger pendant 5 secondes à 600 x g

Etape 3: Protocole du cycle
Se référer au tableau 1 pour le protocole du thermocycleur spécifique aux types de banque.
* Si le point final conventionnel de la PCR a déjà été utilisé avec succès et les mêmes quantité et type de banque ajouté aux réactions de la KAPA HiFi HotStart Real-Time PCR, puis le même programme en temps réel du thermocycleur avec le même nombre de cycles que précédemment utilisé.
* Il est important de s'assurer que l'acquisition des données est réalisée à 72 º C.
Etape 4: Clean up PCR
Après enrichissement par PCR After enrichment PCR, clean up each reaction using either Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter Genomics part # A63881) or Qiagen MinElute PCR purification kit (Qiagen, part # 28004).

Etape 5: Validation des banques
Initialement, les données brutes linéaires (c'est-à-dire sans soustraction du bruit de fond) des "plots" de l'amplification en temps réel peuvent être utilisées comme un indicateur de qualité intégré afin de valider le niveau d'amplification de chaque banque amplifiée.
* Si le profil d'amplification linéaire de la banque est nettement inférieur au fluorescent standard 1 à la fin du cycle de qPCR, alors il est peu probable qu'il y aura suffisamment de matériel de banque pour séquencer après purification par PCR.
* Si le profil d'amplification linéaire de la banque est nettement supérieur au fluorescent standard 3 à la fin du cycle de qPCR, alors la banque a été sur-amplifiée. Cela peut conduire à 1) un biais de l'amplification, 2) de forts taux d'erreurs et/ou 3) la présence de produits de PCR chimériques.
Cette donnée est aussi utile comme indicateur de contrôle de la qualité pour l'identification des incohérences durant la préparation de banque entre plusieurs banques.
REMARQUE: Les "plots" d'amplification peuvent être utilisés en temps réel afin de sélectionner le cycle optimal sans un cycle de fin pré-programmé. Pour ce faire:
1. Programmer 30 cycles dans le thermocycleur en temps réel.
2. Après le démarrage du thermocycleur en temps réel, attendre jusqu'à ce que la fluorescence désirée de la banque soit atteinte avant de mettrefin à la réaction en temps réel.
REMARQUE: Il est essentiel de mettrefin à la réaction immédiatement après l'acquisition de données à 72°C et avant que les tubes à 95°C pour le début du cycle suivant. Cela permettre de s'assurer que la banque ADN enrichie demeure en double-brin pour une purification en aval efficace.

Pour vérifier la taille des fragments de PCR enrichis, vérifier la distribution par taille en effectuant une électrophorèse sur gel.

5.1: Quantification de la banque
Une quantification précise des molécules de la banque amplifiable est essentiel pour une utilisation efficace des plate-formes NGS. La surestimation de la concentration de la banque résulte à une densité moindre des clusters suite à la bridge PCR. La sous-estimation de la concentration des banques est due à des amas trop nombreux dans l'écoulement de cellules, ce qui peut conduire à une pauvre résolution de clusters. Les deux scénarios sont dus à la capacité de séquençage optimale.
La quantification précise des banques est également importante lors de la mise en place de banques indexés pour le séquençage des multiplexés afin d'assurer une représentation équitable de chaque banque.
Utiliser le KAPA HiFi Real-Time PCR Library Amplification Kit avec le KAPA Library Quantification approprié afin de quantifier avec précision le nombre de molécules de PCR compétente. Si les banques ont été terminées entre les fluorescents standards 1 à 3, une dilution unique de 1:1.000 de chaque banque sera requise pour la quantification de la banque en utilisant les coffrets KAPA Library Quantification.