Protocole de PCR quantitative (qPCR) avec SYBR Green pour LightCycler® 480
Ce protocole est destiné à être utilisé mais sans s'y limiter avec Roche LightCycler® 480
Protocole KAPA™ SYBR® FAST qPCR Kit Master Mix (2X) optimized for LightCycler® 480"
Réactifs :
- Matrice ADN
- Amorce sens
- Amorce antisens
- Sonde
- Master Mix (2X)
- Eau de qualité PCR
Protocole général de qPCR
Etape 1: Réaction d'installation de la qPCR
- Avant la préparation des réactions de qPCR reactions, bien mélanger l'ADN matrice, les amorces et les sondes.
- Calculer les volumes requis de chaque composant selon le tableau suivant:
| Final Concentration | 20μl rxn | |
| Eau de qualité PCR jusqu'à 20μl | Selon besoins | |
| Master Mix (2X) qPCR | 1X | 10μl |
| Amorce sens (10μM) | 200 nM | 0.4μl |
| Amorce antisens (10μM) | 200 nM | 0.4μl |
| Matrice ADN | (<20 ng/20μl rxn) | Variable |
Etape 2: Configuration de la plaque
- La préparation du cocktail de réaction est vital pour la qPCR afin de réduire l'effet des erreurs de pipettages entre les échantillons. Assembler tous les éléments ci-dessous à l'exception de la matrice d'ADN ou ADNc.
- Mélanger délicatement tous les composants du cocktail avant de transférer le volume de mélange réactionnel approprié dans chaque tube/plaque de PCR.
- Ajouter la matrice ADN ou ADNc à chaque réaction.
- Les volumes de réaction peuvent être réduits de 20μl à 10μl si des tubes/plaques de faible volume sont utilisés.
- Couvrir ou sceller le tube/ la plaque de réaction et centrifuger brièvement.
Etape 3: Exécution de la réaction qPCR
- Si possible, sélectionner le mode rapide sur l'instrument.
- Programmer le protocole suivant:
- Activation enzymatique à 95 °C pendant 20 sec - 3 min (1 cycle)
- Dénaturer à 95 °C pendant 1 - 3 sec
- Appariement/Elongation/Acquisition à 60 ºC moins de 20 sec
Etape 4: Analyse des résultats
- L'analyse des données varie en fonction de l'instrument utilisé. Se référer à votre guide de l'utilisateur de l'instrument.
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