L'isothiocyanate de tétraméthylrhodamine (TRITC) est un fluorophore largement utilisé pour le marquage des anticorps, reconnu pour sa fluorescence rouge-orangé intense et son excellente photostabilité. Les conjugués anticorps-TRITC sont obtenus par réaction du groupement isothiocyanate du TRITC avec les fonctions amines primaires de l'anticorps (groupes ε-amine des résidus lysine et groupes amines N-terminaux), conduisant à la formation d'une liaison thiourée stable. Après la conjugaison, l'anticorps marqué est purifié afin d'éliminer le TRITC libre non conjugué, garantissant une efficacité de marquage élevée et une fluorescence de fond minimale. La qualité du produit est généralement évaluée par la détermination du rapport molaire fluorophore/protéine (F/P), qui est habituellement compris entre 1,0 et 5,0 pour les conjugués commerciaux, certaines préparations présentant un rapport d'environ 3,2 moles de TRITC par mole d'IgG de lapin.

Production et spécificité

Les anticorps anti-cobaye conjugués au TRITC sont produits par immunisation d'espèces hôtes, telles que le lapin, la chèvre, l'âne ou le mouton, avec des immunoglobulines G (IgG) de cobaye purifiées ou leurs fragments. Les antisérums obtenus sont généralement purifiés par chromatographie d'affinité sur des IgG de cobaye immobilisées, permettant d'isoler sélectivement les anticorps de haute affinité tout en éliminant les protéines sériques non spécifiques et les immunoglobulines présentant des réactions croisées. Afin d'améliorer encore leur spécificité, de nombreux anticorps commerciaux font l'objet d'une étape supplémentaire de pré-adsorption contre les protéines sériques d'autres espèces, réduisant significativement les réactions croisées et rendant ces réactifs particulièrement adaptés aux expériences complexes d'immunofluorescence multiparamétrique.

Applications et recommandations

Les anticorps anti-cobaye conjugués au TRITC sont largement utilisés dans les techniques de détection par fluorescence, notamment en immunohistochimie (IHC), en immunocytochimie et immunofluorescence (ICC/IF), en cytométrie en flux et en Western blot fluorescent. Le fluorophore TRITC présente un maximum d'excitation d'environ 543 à 550 nm et un maximum d'émission d'environ 570 à 572 nm, ce qui le rend parfaitement compatible avec les jeux de filtres standard pour la rhodamine et particulièrement adapté aux analyses de fluorescence multiplex en association avec des fluorophores tels que le FITC. Les dilutions initiales couramment recommandées sont d'environ 1:16 pour l'immunofluorescence directe sur des cellules spléniques de cobaye et 1:160 pour l'immunohistochimie sur des coupes tissulaires fixées au formol et incluses en paraffine. Les performances de marquage pouvant varier en fonction du type d'échantillon et des conditions expérimentales, une optimisation empirique de la concentration en anticorps est recommandée afin d'obtenir le meilleur rapport signal/bruit.