Western-Blot-Transferpuffer ist ein wichtiges Reagenz bei der elektrophoretischen Proteinübertragung und ermöglicht die Migration von Proteinen aus SDS-PAGE-Gelen auf Nitrocellulose- oder PVDF-Membranen zur anschließenden Immunnachweisführung. Seit der grundlegenden Arbeit von Towbin, Staehelin und Gordon, die den elektrophoretischen Transfer von Proteinen aus Polyacrylamidgelen auf Nitrocellulosemembranen demonstrierten, ist die Zusammensetzung des Transferpuffers ein zentraler Faktor für die Leistung, Reproduzierbarkeit und Signalqualität von Western Blots.

Rolle bei der Effizienz der Proteinübertragung

Ein Standard-Transferpuffer für Western Blots enthält üblicherweise Tris-Base und Glycin, wobei häufig Methanol zugesetzt wird, um die Proteinbindung an die Membran zu unterstützen und die Gelintegrität während der Elektrotransferrierung zu erhalten. Beim SDS-PAGE-basierten Western Blotting werden Proteine nach ihrem Molekulargewicht getrennt und anschließend auf einer Membran immobilisiert, wo sie für Antikörper zugänglich bleiben, wie in den klassischen immunologischen Studien von Burnette beschrieben. Der Puffer muss daher eine geeignete Ionenstärke und Leitfähigkeit gewährleisten und gleichzeitig das während der Elektrophorese erhaltene Proteinmuster bewahren.

Optimierung für Western-Blot-Anwendungen

Der optimale Transferpuffer hängt von der Proteingröße, dem Gelanteil, dem Transfersystem und dem Membrantyp ab. Methanolhaltige Transferpuffer werden häufig für viele Routineziele verwendet, während reduzierte Methanolkonzentrationen oder SDS-haltige Formulierungen den Transfer hochmolekularer Proteine verbessern können. Ein zu hoher SDS-Gehalt oder ungeeignete Pufferbedingungen können jedoch den Hintergrund erhöhen, Wärmeentwicklung verursachen oder die effiziente Membranbindung beeinträchtigen. Für eine zuverlässige Western-Blot-Analyse ist daher die Auswahl des richtigen Transferpuffers entscheidend, um die Proteinausbeute zu maximieren, die Bandauflösung zu erhalten und die Empfindlichkeit chemilumineszenter, kolorimetrischer oder fluoreszenter Nachweisverfahren zu verbessern.

Referenzen

• Towbin H., Staehelin T., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets. PNAS, 1979;76(9):4350–4354. DOI: 10.1073/pnas.76.9.4350.
• Burnette W.N. “Western blotting”: electrophoretic transfer of proteins from SDS-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose. Analytical Biochemistry, 1981;112(2):195–203. DOI: 10.1016/0003-2697(81)90281-5.