NeoTaq II Mastermix
Beschreibung
- NeoTaq II Master Mix: Sofort einsatzbereiter Mix für robuste und zuverlässige Standard-PCR.
- Enthält DNA-Polymerase, dNTPs, Reaktionspuffer und optimierte Additive.
- Unterstützt die Amplifikation von DNA-Templates bis zu 6 kb.
- 2,5 mM MgCl₂ ermöglicht flexible PCR-Protokolle.
- Blaue und gelbe Tracking-Farbstoffe ermöglichen das direkte Auftragen auf Agarosegele.
- Keine 3′→5′-Exonuklease-Aktivität; produziert A-Overhangs, die sich für das TA-Klonieren eignen.
- Für fluoreszenz- oder absorptionsbasierte Downstream-Anwendungen PCR-Produkte zuerst aufreinigen oder die farbstofffreie Version verwenden.
Lagerungsbedingungen
Dieser Master Mix sollte bei -85 °C bis -15 °C in einem Gefrierschrank ohne Abtauzyklen gelagert werden, um eine maximale Haltbarkeit zu gewährleisten. Die hohe thermische Stabilität der Enzymmischung ermöglicht es ihr, bei 4 °C oder sogar bei Raumtemperatur für bis zu 4 Wochen stabil zu bleiben. Das Produkt bleibt bei vorschriftsmäßiger Lagerung bis zum Verfallsdatum stabil.
Qualitätskontrolltests
Reinheit
Die Reinheit der NeoTaq II DNA-Polymerase ist >90 %, beurteilt durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese gefolgt von Coomassie-Blau-Färbung.
Genomische DNA-Kontamination
Das Produkt muss frei von jeglicher nachweisbaren DNA-Kontamination sein, wie durch PCR evaluiert. Somit ist es für die Amplifikation von bakterieller und pilzlicher DNA basierend auf 16S- und 18S-rRNA-PCR-Assays geeignet.
Nuklease-Assays
0,2-0,3 μg Plasmid-DNA werden mit dem NeoTaq II Master Mix für 14-16 Stunden bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wird die DNA auf einem beliebigen Safe-DNA-Gel-Stain-gefärbten Agarosegel visualisiert. Es darf keine sichtbare Strangtrennung oder Zersetzung der Nukleinsäure auftreten.
Funktionstest
Der NeoTaq II Master Mix wird auf seine Leistung in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur Amplifikation verschieden großer DNA-Fragmente (1 und 2,5 kb) aus humaner genomischer DNA getestet. Die resultierenden PCR-Produkte werden als einzelne Banden in einem beliebigen Safe-DNA-Gel-Stain-gefärbten Agarosegel visualisiert.
Fehlerbehebung
Keine Produktamplifikation oder geringer Ertrag
Ungeeignete Annealing-Temperatur
Die Zusammensetzung des Reaktionsmixes kann die Schmelzeigenschaften von Primern und DNA beeinflussen. Passen Sie die Annealing-Temperatur an, um den Primer mit der niedrigsten Schmelztemperatur zu berücksichtigen (5 ° bis 10 °C niedriger als die Tm).
Vorhandensein von PCR-Inhibitoren
Einige DNA-Isolierungsverfahren, insbesondere die Isolierung genomischer DNA, können zur Co-Aufreinigung von PCR-Inhibitoren führen. Reduzieren Sie das Volumen der Template-DNA in der Reaktion oder verdünnen Sie die Template-DNA vor der Zugabe zur Reaktion. Es hat sich gezeigt, dass die Verdünnung von Proben um bis zu 1:10.000 wirksam zur Verbesserung der Ergebnisse ist, abhängig von der anfänglichen DNA-Konzentration.
Mg2+-Konzentration ist zu niedrig
Mg2+ ist im Master Mix in einer Endkonzentration von 2,5 mM enthalten, was für die meisten Targets ausreicht. Für einige Targets kann eine höhere Mg2+-Konzentration erforderlich sein. Titrieren Sie von 2,5 mM auf 4 mM (Endkonzentration) in 0,5-mM-Schritten. (Hinweis: MgCl2 wird nicht in separaten Röhrchen geliefert).
Vorhandensein von unspezifischen Banden
Unspezifisches Annealing von Primern
Passen Sie die Annealing-Bedingungen an und/or entwerfen Sie einen anderen Satz von Primern, indem Sie die Länge erhöhen und komplementäre Sequenzen vermeiden.