Materiali di consumo per Western blot comprendono i prodotti necessari per trasferire le proteine da un gel di elettroforesi a un supporto solido e successivamente rilevarle mediante metodi immunologici. La tecnica Western blot si basa su questo trasferimento verso una membrana di supporto seguito dall'immunorilevazione, rendendola una tecnica ampiamente utilizzata per la visualizzazione e l'identificazione delle proteine. Questa categoria comprende principalmente membrane di trasferimento, carte filtro per blotting, tamponi di trasferimento e lavaggio, nonché reagenti di blocco e rilevazione.
Componenti principali
Il supporto di trasferimento è generalmente di uno dei due tipi: nitrocellulosa o fluoruro di polivinilidene (PVDF), entrambi in grado di legare le proteine con elevata affinità. Le membrane PVDF devono essere bagnate preventivamente in metanolo al 100% prima dell'uso, anche se successivamente possono essere utilizzate con un tampone di trasferimento privo di metanolo. La carta filtro per blotting, realizzata in fibra di cotone al 100%, garantisce un flusso uniforme del tampone attraverso il gel e non contiene additivi che potrebbero interferire con il processo di trasferimento. È disponibile in formati con spessore standard ed extra-spesso; quest'ultimo è consigliato per i trasferimenti semi-secchi grazie alla maggiore capacità di trattenere liquidi. Il tampone di trasferimento utilizzato nell'elettroblotting è generalmente composto da base Tris, glicina e metanolo (concentrazione variabile in base al protocollo specifico), mentre un tampone di lavaggio TBST (soluzione salina tamponata con Tris contenente 0,05% di Tween-20) e un tampone di blocco (ad esempio albumina sierica bovina al 5%) vengono utilizzati nelle fasi successive. I reagenti di blocco devono saturare tutti i siti non reattivi sulla membrana senza rimuovere la proteina bersaglio o interferire con gli anticorpi o i reagenti di rilevazione.
Formati e applicazioni
Sono oggi disponibili membrane e carte filtro pretagliate, così come sandwich di trasferimento preassemblati, adattati direttamente alle dimensioni del gel, semplificando e velocizzando la procedura. Alcuni sistemi integrano una membrana di trasferimento preattivata direttamente in una pila di materiali di consumo, consentendo il trasferimento a secco in pochi minuti. A seconda del metodo di rilevazione utilizzato (colorimetrico, chemiluminescente o fluorescente), la scelta della membrana può influenzare il segnale e il livello di fondo. Ad esempio, sono state sviluppate membrane PVDF a bassa autofluorescenza specificamente per ridurre il rumore di fondo nelle rilevazioni basate sulla fluorescenza. Il trasferimento elettroforetico può essere eseguito in condizioni umide o semi-secche; il trasferimento umido è generalmente considerato più affidabile, soprattutto per proteine di grandi dimensioni, poiché riduce il rischio di essiccazione del gel.
