Western blot-transferbuffer is een essentieel reagens bij de elektroforetische eiwitoverdracht en maakt de migratie van eiwitten vanuit SDS-PAGE-gels naar nitrocellulose- of PVDF-membranen mogelijk voor verdere immunodetectie. Sinds het baanbrekende werk van Towbin, Staehelin en Gordon, waarin de elektroforetische overdracht van eiwitten van polyacrylamidegels naar nitrocellulosemembranen werd aangetoond, is de samenstelling van de transferbuffer een centrale factor gebleven voor de prestaties, reproduceerbaarheid en signaalkwaliteit van western blot.
Rol bij de efficiëntie van eiwitoverdracht
Een standaard western blot-transferbuffer bevat meestal Tris-base en glycine, waarbij vaak methanol wordt toegevoegd om de binding van eiwitten aan het membraan te ondersteunen en de integriteit van de gel tijdens elektrotransfer te behouden. Bij SDS-PAGE-gebaseerde western blotting worden eiwitten gescheiden op basis van molecuulgewicht en vervolgens geïmmobiliseerd op een membraan, waar ze toegankelijk blijven voor antilichamen, zoals beschreven in klassieke immunoblottingstudies van Burnette. De buffer moet daarom een geschikte ionsterkte en geleidbaarheid bieden en tegelijkertijd het eiwitpatroon behouden dat tijdens de elektroforese is verkregen.
Optimalisatie voor western blot-toepassingen
De optimale transferbuffer hangt af van de grootte van het eiwit, het gelpercentage, het transfersysteem en het type membraan. Transferbuffers met methanol worden veel gebruikt voor veel routinematige doelen, terwijl formuleringen met minder methanol of toevoeging van SDS de overdracht van eiwitten met een hoog molecuulgewicht kunnen verbeteren. Te veel SDS of ongeschikte buffercondities kunnen echter achtergrondsignalen verhogen, warmteontwikkeling veroorzaken of de efficiënte membraanbinding verminderen. Voor betrouwbare western blot-analyse is het kiezen van de juiste transferbuffer daarom essentieel om eiwitherstel te maximaliseren, bandresolutie te behouden en de gevoeligheid van chemiluminescente, colorimetrische of fluorescente detectiemethoden te verbeteren.
Referenties
- Towbin H., Staehelin T., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets. PNAS, 1979;76(9):4350–4354. DOI: 10.1073/pnas.76.9.4350.
- Burnette W.N. “Western blotting”: electrophoretic transfer of proteins from SDS-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose. Analytical Biochemistry, 1981;112(2):195–203. DOI: 10.1016/0003-2697(81)90281-5.
