NeoTaq II-mastermix
Beschrijving
- NeoTaq II Master Mix: kant-en-klare mix voor robuuste en betrouwbare standaard-PCR.
- Bevat DNA-polymerase, dNTP's, reactiebuffer en geoptimaliseerde additieven.
- Ondersteunt de amplificatie van DNA-sjablonen tot 6 kb.
- 2,5 mM MgCl₂ maakt flexibele PCR-protocollen mogelijk.
- Blauwe en gele volgteluringskleurstoffen maken directe belading op agarosegel mogelijk.
- Geen 3′→5′-exonucleaseactiviteit; produceert A-overhangs die geschikt zijn voor TA-klonering.
- Voor fluorescentie- of absorptiegebaseerde stroomafwaartse toepassingen, PCR-producten eerst zuiveren of de kleurstofvrije versie gebruiken.
Opslagomstandigheden
Deze master mix moet worden bewaard bij -85 °C tot -15 °C in een vriezer zonder ontdooicycli om een maximale houdbaarheid te garanderen. De hoge thermische stabiliteit van het enzymmengsel zorgt ervoor dat het tot 4 weken stabiel blijft bij 4 °C of zelfs bij kamertemperatuur. Het product blijft stabiel tot de vervaldatum indien bewaard zoals gespecificeerd.
Kwaliteitscontroleassays
Zuiverheid
De zuiverheid van NeoTaq II DNA-polymerase is >90% zoals beoordeeld door SDS-polyacrylamide gelelektroforese gevolgd door Coomassie Blue kleuring.
Genomische DNA-contaminatie
Het product moet vrij zijn van elke detecteerbare DNA-contaminatie zoals geëvalueerd via PCR. Het is daarom geschikt voor de amplificatie van bacteriële en schimmel-DNA op basis van 16S en 18S rRNA PCR-assays.
Nuclease-assays
0,2-0,3 μg plasmide-DNA wordt geïncubeerd met NeoTaq II Master mix gedurende 14-16 uur bij 37 °C. Na incubatie wordt het DNA gevisualiseerd op een met Safe DNA Gel Stain gekleurd agarosegel. Er mogen geen zichtbare inkepingen of knippen in het nucleïnezuur aanwezig zijn.
Functionele assay
NeoTaq II Master mix wordt getest op prestaties in een polymerasekettingreactie (PCR) voor de amplificatie van DNA-fragmenten van verschillende grootte (1 en 2,5 kb) uit humaan genomisch DNA. De resulterende PCR-producten worden gevisualiseerd als enkele banden in een met Safe DNA Gel Stain gekleurd agarosegel.
Probleemoplossing
Geen productamplificatie of lage opbrengst
Onvoldoende annealingstemperatuur
De samenstelling van de reactiemix kan de smelteigenschappen van primers en DNA beïnvloeden. Pas de annealingstemperatuur aan om deze af te stemmen op de primer met de laagste smelttemperatuur (5 °C tot 10 °C lager dan de Tm).
Aanwezigheid van PCR-inhibitoren
Sommige DNA-isolatieprocedures, met name de isolatie van genomisch DNA, kunnen resulteren in de co-zuivering van PCR-inhibitoren. Verminder het volume sjabloon-DNA in de reactie of verdun het sjabloon-DNA voordat het aan de reactie wordt toegevoegd. Het is gebleken dat het zelfs 1:10.000 verdunnen van monsters effectief is om de resultaten te verbeteren, afhankelijk van de initiële DNA-concentratie.
Concentratie van Mg2+ is te laag
Mg2+ is opgenomen in de Master Mix bij een eindconcentratie van 2,5 mM, wat voldoende is voor de meeste targets. Voor sommige targets kan een hogere Mg2+-concentratie vereist zijn. Titreer van 2,5 mM tot 4 mM (eindconcentratie) in stappen van 0,5 mM. (Opmerking: MgCl2 wordt niet meegeleverd in afzonderlijke buisjes).
Aanwezigheid van unspecifieke banden
Niet-specifieke annealing van primers
Pas de annealingcondities aan en/of ontwerp een andere set primers, door de lengte te vergroten en complementaire sequenties te vermijden.