Mezcla maestra NeoTaq II
Descripción
- NeoTaq II Master Mix: mezcla lista para usar para una PCR estándar robusta y fiable.
- Contiene ADN polimerasa, dNTPs, tampón de reacción y aditivos optimizados.
- Permite la amplificación de moldes de ADN de hasta 6 kb.
- MgCl₂ a 2,5 mM que permite protocolos de PCR flexibles.
- Los colorantes de seguimiento azul y amarillo permiten la carga directa en geles de agarosa.
- Sin actividad exonucleasa 3′→5′; produce extremos salientes A adecuados para la clonación TA.
- Para aplicaciones posteriores basadas en fluorescencia o absorbancia, purifique primero los productos de PCR o utilice la versión sin colorante.
Condiciones de almacenamiento
Esta mezcla maestra debe almacenarse a una temperatura de -85 °C a -15 °C en un congelador sin ciclos de descongelación para garantizar una vida útil máxima. La alta estabilidad térmica de la mezcla de enzimas le permite permanecer estable a 4 °C o incluso a temperatura ambiente durante un máximo de 4 semanas. El producto se mantendrá estable hasta la fecha de caducidad si se almacena según lo especificado.
Ensayos de control de calidad
Pureza
La pureza de la ADN polimerasa NeoTaq II es >90% según se juzga mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS seguida de tinción con azul de Coomassie.
Contaminación de ADN genómico
El producto debe estar libre de cualquier contaminación de ADN detectable según se evalúa mediante PCR. Por lo tanto, es adecuado para la amplificación de ADN bacteriano y fúngico basándose en ensayos de PCR de ARNr 16S y 18S.
Ensayos de nucleasas
Se incuban 0,2-0,3 μg de ADN plasmídico con NeoTaq II Master mix durante 14-16 horas a 37 °C. Tras la incubación, el ADN se visualiza en cualquier gel de agarosa teñido con Safe DNA Gel Stain. No debe haber mellas ni cortes visibles en el ácido nucleico.
Ensayo funcional
El NeoTaq II Master mix se prueba en cuanto a su rendimiento en una reacción en cadena de la polimerase (PCR) para la amplificación de fragmentos de ADN de diferentes tamaños (1 y 2,5 kb) a partir de ADN genómico humano. Los productos de PCR resultantes se visualizan como bandas individuales en cualquier gel de agarosa teñido con Safe DNA Gel Stain.
Resolución de problemas
Sin amplificación del producto o bajo rendimiento
Temperatura de hibridación inadecuada
La composición de la mezcla de reacción puede afectar a las propiedades de fusión de los cebadores y del ADN. Ajuste la temperatura de hibridación para adaptarla al cebador con la temperatura de fusión más baja (de 5 °C a 10 °C por debajo de la Tm).
Presencia de inhibidores de PCR
Algunos procedimientos de aislamiento de ADN, en particular el aislamiento de ADN genómico, pueden dar lugar a la copurificación de inhibidores de PCR. Reduzca el volumen de ADN molde en la reacción o diluya el ADN molde antes de añadirlo a la reacción. Se ha demostrado que la dilución de las muestras incluso en una proporción de 1:10.000 es eficaz para mejorar los resultados, dependiendo de la concentración inicial de ADN.
La concentración de Mg2+ es demasiado baja
El Mg2+ se incluye en la Master Mix a una concentración final de 2,5 mM, lo cual es suficiente para la mayoría de los blancos. Para algunos blancos, puede ser necesaria una concentración de Mg2+ más alta. Realice una titulación desde 2,5 mM hasta 4 mM (concentración final) en incrementos de 0,5 mM. (Nota: El MgCl2 no se suministra en tubos separados).
Presencia de bandas no específicas
Hibridación no específica de cebadores
Ajuste las condiciones de hibridación y/o diseñe otro conjunto de cebadores, aumentando la longitud y evitando secuencias complementarias.