Hot-start NeoTaq II DNA polymerase
Referencia NB-60-0008
embalaje : 500U
Marca : Neo Biotech
Datasheet (EN)
Polimerasa de ADN NeoTaq II de inicio en caliente
Descripción
- ADN polimerasa Hot-start NeoTaq II es una ADN polimerasa modificada con actividad de PCR similar a hot-start.
- La actividad limitada a temperatura ambiente ayuda a prevenir la extensión inespecífica de cebadores y la formación de dímeros de cebadores.
- Proporciona mayor especificidad, sensibilidad y rendimiento de ADN en la PCR.
- Se activa en 5 minutos a 95°C para un inicio rápido de la reacción.
- Admite la amplificación de moldes de ADN de hasta 6 kb con tiempos de extensión rápidos de 15–30 s/kb.
- Requiere una optimización mínima de la PCR y permite la preparación de la reacción a temperatura ambiente.
- La ADN polimerasa Hot-start NeoTaq II carece de actividad exonucleasa 3′→5′ (corrección de pruebas).
- Genera productos de PCR con salientes A en 3′, adecuados para clonación TA con kits de clonación por PCR.
Condiciones de almacenamiento y preparación de reactivos
Este producto debe almacenarse a una temperatura de -85 °C a -15 °C en un congelador sin ciclos de descongelación para garantizar una vida útil máxima. El producto se mantendrá estable hasta la fecha de caducidad si se almacena según lo especificado.
Ensayo de control de calidad
Pureza
La pureza de la ADN polimerasa Hot-start NeoTaq II es > 90 % según se determina mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS seguida de tinción con azul de Coomassie.
Contaminación de ADN genómico
El producto debe cumplir con los estándares internos de contaminación por ADN evaluados mediante qPCR en tiempo real.
Ensayos de nucleasas
0,2-0,3 μg de ADN plasmídico se incuban con 5 U de ADN polimerasa Hot-start NeoTaq II, en tampón de reacción 1×, durante 14-16 horas a 37 °C. Tras la incubación, el ADN se visualiza en un gel de agarosa teñido con colorante Safe DNA Gel Stain. No debe haber mellas ni cortes visibles en el ácido nucleico. Se realizan pruebas similares con el tampón Hot-start NeoTaq II y la solución de MgCl2.
Ensayo funcional
La ADN polimerasa Hot-start NeoTaq II se prueba exhaustivamente en cuanto a su rendimiento en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de fragmentos de ADN de diferentes tamaños (1 y 2,5 kb) de ADN genómico humano. Los productos de PCR resultantes se visualizan como bandas individuales en un gel de agarosa teñido con Safe DNA Gel Stain. Se realizan pruebas funcionales similares con el tampón Hot-start NeoTaq II y la solución de MgCl2.
Resolución de problemas
Ausencia de amplificación del producto o bajo rendimiento
• Temperatura de hibridación inadecuada
La composición de la mezcla de reacción puede afectar a las propiedades de fusión de los cebadores y del ADN. Ajuste la temperatura de hibridación para adaptarla al cebador con la temperatura de fusión más baja (5 °C a 10 °C por debajo de la Tm).
• Presencia de inhibidores de la PCR
Algunos procedimientos de aislamiento de ADN, en particular el aislamiento de ADN genómico, pueden dar lugar a la copurificación de inhibidores de la PCR. Reduzca el volumen de ADN molde en la reacción o diluya el ADN molde antes de agregarlo a la reacción. Se ha demostrado que diluir las muestras incluso 1:10.000 es eficaz para mejorar los resultados, dependiendo de la concentración inicial de ADN.
• Aditivos necesarios
La adición de agentes potenciadores de la PCR (solución optimizadora 5× o solución potenciadora de GC 2×) puede mejorar el rendimiento al tiempo que permite la amplificación de moldes difíciles.
Presencia de bandas inespecíficas
• Hibridación inespecífica de cebadores
Ajuste las condiciones de hibridación y/o diseñe otro juego de cebadores, aumentando la longitud y evitando secuencias complementarias.
• La concentración de Mg2+ es demasiado alta
Por lo general, de 1,5 a 3 mM de MgCl2, típicamente una concentración final de 2,5 mM, funciona bien para la mayoría de las reacciones de PCR. La concentración óptima depende del molde diana, el tampón y los dNTP. Optimice la concentración de magnesio añadiendo MgCl2 en incrementos de 0,5 hasta 4 mM.