Gli anticorpi secondari possono essere classificati in base alla loro specificità, che può essere ampia o ristretta, e al loro tipo di frammento, che può essere intero, F(ab) o F(ab')2.

Il principio di F(ab')2 è generare frammenti di anticorpi divalenti che mantengono le porzioni Fab di legame all'antigene degli anticorpi IgG interi, rimuovendo la maggior parte della regione Fc.

I frammenti F(ab')2 vengono generati tramite digestione con pepsina degli anticorpi IgG interi per tagliare la regione della cerniera e lasciare intatta una parte della regione Fc. I frammenti risultanti hanno due porzioni Fab di legame all'antigene collegate tra loro da legami disolfuro, rendendoli divalenti con un peso molecolare di circa 110 kDa. L'uso dei frammenti F(ab')2 presenta diversi vantaggi rispetto agli anticorpi IgG interi, tra cui una migliore penetrazione nei tessuti, una minore legame non specifico ai recettori Fc sulle cellule vive o alla proteina A/G, e la capacità di precipitare gli antigeni. Tuttavia, i frammenti F(ab')2 non sono raccomandati per il blocco poiché hanno due siti di legame che sono disponibili per catturare l'anticorpo primario che verrà introdotto successivamente. La preparazione dei frammenti F(ab')2 comporta la digestione con pepsina degli anticorpi IgG interi, seguita da purificazione utilizzando tecniche come FPLC con DEAE-