2. Diferenciación del trofoblasto
La diferenciación del trofoblasto está gobernada por programas coordinados de señalización, transcripción y epigenéticos que regulan el mantenimiento de los progenitores del citotrofoblasto (CTB) y el compromiso hacia los estados de sincitiotrofoblasto (STB) y trofoblasto extravelloso (EVT). Estos mecanismos se han investigado utilizando sistemas complementarios de células madre de trofoblasto humanas y de ratón, modelos de diferenciación de células madre pluripotentes humanas, cultivos primarios de trofoblasto, organoides y embriones de ratón manipulados genéticamente. Aunque varias vías reguladoras son compartidas, la especificación y diferenciación del linaje del trofoblasto no están completamente conservadas entre especies; en particular, el linaje EVT humano no tiene un equivalente directo uno a uno en el ratón.
Especificación transcripcional y el eje Hippo/TEAD4
En el concepto de ratón, la actividad diferencial de la vía Hippo vincula la posición celular y el contacto intercelular con la especificación del trofoblasto. La fosforilación mediada por LATS restringe el YAP nuclear en las células internas, mientras que la actividad reducida de la vía Hippo permite la interacción nuclear de YAP con TEAD4 en las células externas. La actividad de TEAD4 se asocia por tanto con la especificación del trophectodermo y la activación de programas transcripcionales asociados al trofoblasto, incluyendo Cdx2. GATA3 actúa dentro de la red reguladora asociada a TEAD4 y contribuye, junto con CDX2, a la especificación y diferenciación del trofoblasto en el ratón. La red transcripcional centrada en ELF5 proporciona una capa adicional de regulación de las células madre del trofoblasto. Los cambios en la abundancia de ELF5 influyen en sus interacciones con reguladores transcripcionales incluyendo EOMES y TFAP2C y modifican el equilibrio entre los programas transcripcionales asociados a la autorrenovación y a la diferenciación.
En los modelos de trofoblasto humano, las relaciones reguladoras entre TEAD4, CDX2, GATA3 y otros reguladores del linaje son más complejas y no deben asumirse como una reproducción directa de la jerarquía del ratón.
Señalización BMP y compromiso del trofoblasto humano
BMP4 se utiliza ampliamente de forma experimental para inducir la diferenciación asociada al trofoblasto a partir de células madre pluripotentes humanas. La exposición a BMP4 activa programas transcripcionales asociados al trofoblasto mientras suprime estados asociados a la pluripotencia en varios sistemas experimentales. Los estudios de diferenciación dirigida por BMP4 han identificado un intermedio similar al citotrofoblasto positivo para ΔNp63 en algunos modelos de células madre pluripotentes humanas antes de la diferenciación posterior del trofoblasto. Una red transcripcional GATA2/3–TFAP2A/C también se ha asociado con la adquisición y el mantenimiento de la identidad del trofoblasto, mientras que GATA3 contribuye al compromiso del trofoblasto en sistemas de diferenciación basados en BMP4.
Las respuestas a BMP4 están fuertemente influenciadas por la modulación simultánea de vías competidoras. Los protocolos de diferenciación de células madre pluripotentes humanas han incorporado por tanto la inhibición de la señalización de Activin/Nodal/TGF-β y FGF para sesgar la diferenciación hacia estados asociados al trofoblasto. Estas condiciones son experimentales y dependientes del sistema y no deben interpretarse como una representación universal de la especificación o diferenciación fisiológica del trofoblasto humano.
Señalización Wnt/β-catenina y diferenciación del trofoblasto
La señalización canónica Wnt/β-catenina contribuye a la regulación y diferenciación de las células madre del trofoblasto, pero sus efectos dependen altamente del estado celular, el contexto del desarrollo y las condiciones experimentales. La manipulación experimental de la señalización Wnt en modelos de trofoblasto humano puede modificar la proliferación, diferenciación, migración, invasión y la expresión de genes asociados al linaje. Estas observaciones apoyan un papel de la transcripción dependiente de Wnt en la diferenciación del trofoblasto y los fenotipos invasivos, pero no establecen la activación de Wnt como un determinante único o universal de la especificación del EVT.
La señalización Wnt debe considerarse por tanto en conjunción con otros mecanismos reguladores del linaje que controlan la adhesión celular, la migración, las interacciones con la matriz extracelular y el estado de diferenciación del trofoblasto, en lugar de como un impulsor aislado del desarrollo del EVT.
Señalización Notch y TGF-β/SMAD
La señalización Notch tiene un papel establecido experimentalmente en el desarrollo del linaje del trofoblasto humano. NOTCH1 se asocia con el desarrollo del EVT, y la manipulación experimental de la señalización de NOTCH1 altera la diferenciación hacia el linaje extravelloso. NOTCH2 muestra patrones de expresión distintos entre los subtipos de CTB del primer trimestre, consistentes con una regulación dinámica de la señalización de la familia Notch a través de las poblaciones de trofoblasto y los estados de diferenciación, aunque las diferencias de expresión no deben interpretarse por sí solas como evidencia de un papel funcional específico.
La señalización TGF-β depende de forma similar del subtipo de trofoblasto y del estado de desarrollo. Los análisis experimentales de la fosforilación, localización y expresión de SMAD2/3 demuestran una activación diferencial de la señalización canónica TGF-β a través de las poblaciones de trofoblasto del primer trimestre. Estos hallazgos apoyan un papel dependiente del contexto de la señalización TGF-β/SMAD en la diferenciación del trofoblasto en lugar de un efecto uniforme en todas las poblaciones de trofoblasto.
Señalización de hipoxia/HIF y diferenciación del EVT
La disponibilidad de oxígeno representa un regulador ambiental manipulable experimentalmente de la diferenciación del trofoblasto. La tensión reducida de oxígeno puede dirigir CTBs humanos primarios hacia un fenotipo asociado al EVT, y esta respuesta depende, al menos en parte, de la señalización del factor inducible por hipoxia. Los cambios asociados a la hipoxia incluyen alteraciones en la morfología celular, la adhesión y los programas de diferenciación, vinculando el eje hipoxia/HIF/trofoblasto con la adquisición de características asociadas al EVT. Estas observaciones indican que la señalización dependiente del oxígeno puede modular la diferenciación del trofoblasto, mientras que la respuesta precisa sigue dependiendo de la concentración de oxígeno, el estado de desarrollo y el modelo experimental.
Cultivo de células madre de trofoblasto y diferenciación dirigida
Las células madre de trofoblasto humanas proporcionan un sistema experimental para investigar la autorrenovación y la diferenciación del linaje del trofoblasto. Los sistemas de cultivo de TSC humanas establecidos incorporan señalización del factor de crecimiento epidérmico, activación canónica de Wnt, inhibición de vías que promueven la diferenciación e inhibición de ROCK durante los procedimientos de cultivo apropiados. En el sistema de TSC humanas establecido, la modulación adicional del estado epigenético, incluyendo la inhibición de la histona deacetilasa, contribuye al mantenimiento del estado de células madre del trofoblasto.
La manipulación experimental de vías puede involucrar CHIR99021 para estimular la señalización canónica Wnt, A83-01 o inhibidores relacionados para suprimir la señalización de Activin/TGF-β, EGF para apoyar la propagación de células madre de trofoblasto e Y-27632 para inhibir el estrés celular dependiente de ROCK durante procedimientos seleccionados. Los sistemas de diferenciación basados en BMP4 pueden utilizar adicionalmente inhibidores de vías como A83-01 y, en contextos experimentales específicos, PD173074 para modular señales competidoras de TGF-β y FGF. Estos reactivos representan componentes de sistemas experimentales distintos y no deben interpretarse como una única formulación estandarizada de diferenciación del trofoblasto.
La elevación mediada por forskolina del cAMP intracelular se utiliza experimentalmente para promover la sincitialización del trofoblasto y fenotipos asociados al STB. En estos sistemas, la fusión celular va acompañada de cambios transcripcionales y morfológicos asociados a la diferenciación del sincitiotrofoblasto.
Las TSC de ratón proporcionan un modelo genético complementario en el que reguladores como TEAD4, GATA3, ELF5, EOMES y TFAP2C pueden manipularse directamente para investigar la stemness del trofoblasto, la especificación del linaje y la diferenciación. Los hallazgos de este modelo siguen siendo esenciales para definir mecanismos transcripcionales causales, pero deben interpretarse en el contexto de las diferencias específicas de especie en el desarrollo del trofoblasto.
Organoides de trofoblasto tridimensionales
Los organoides de trofoblasto humanos tridimensionales proporcionan un modelo en el que las poblaciones progenitoras de CTB pueden mantenerse y diferenciarse dentro de un entorno multicelular organizado. Los sistemas de organoides de trofoblasto humanos reproducen características importantes del desarrollo temprano del trofoblasto placentario y pueden generar poblaciones de trofoblasto diferenciadas relevantes para la biología del STB y, bajo condiciones experimentales apropiadas, del EVT.
Los sistemas de cultivo de organoides definidos pueden incorporar EGF, modulación de la vía canónica Wnt, inhibición de la vía TGF-β y componentes adicionales de factores de crecimiento o matriz extracelular para apoyar la autorrenovación y diferenciación del trofoblasto. Las matrices de matriz extracelular proporcionan soporte estructural para la formación de organoides tridimensionales y la organización epitelial. Sin embargo, la composición de la matriz y la disponibilidad de factores de crecimiento pueden influir en el estado celular y la diferenciación, haciendo de la composición de la matriz extracelular una variable experimental importante.
Análisis de célula única y resolución del linaje
La secuenciación de ARN de célula única proporciona un análisis de alta resolución de la heterogeneidad del trofoblasto que no se obtiene de mediciones transcriptómicas a granel. Los enfoques transcriptómicos de célula única y de inferencia de trayectorias han identificado estados de trofoblasto transcripcionalmente distintos y han permitido la inferencia de relaciones de desarrollo entre CTBs progenitores, CTBs en diferenciación, poblaciones asociadas al STB y poblaciones asociadas al EVT. Estos enfoques también facilitan la comparación del tejido placentario primario con modelos de células madre de trofoblasto y organoides.
La inferencia de trayectorias y los análisis pseudotemporales deben interpretarse no obstante como modelos computacionales de relaciones de desarrollo en lugar de prueba experimental directa de transiciones de linaje. Se requieren análisis complementarios de trazado de linaje, perturbación, funcionales y temporales para establecer relaciones causales de linaje.
En el ratón, la manipulación genética del linaje y los enfoques de pérdida o ganancia de función proporcionan evidencia complementaria de relaciones causales entre la actividad de factores de transcripción y el destino del trofoblasto. La manipulación experimental de Tead4, Gata3 y Elf5, junto con análisis de diferenciación de células madre y de embriones, se ha utilizado para distinguir reguladores requeridos para la identidad del trofoblasto de factores asociados secundariamente con la diferenciación.
Validación molecular y celular
La validación de la diferenciación del trofoblasto generalmente requiere mediciones moleculares, celulares y funcionales concordantes. KRT7/CK7 se utiliza ampliamente como marcador asociado al trofoblasto, aunque no es exclusivamente específico de los trofoblastos. La expresión asociada a CGB/hCG se evalúa frecuentemente durante la diferenciación del STB y refleja programas endocrinos del trofoblasto y asociados a la sincitialización en lugar de constituir un marcador definitivo independiente de la identidad del STB. HLA-G se utiliza comúnmente para identificar poblaciones asociadas al EVT, particularmente EVT diferenciado/invasivo, pero debe interpretarse igualmente junto con marcadores de linaje adicionales y propiedades funcionales.
La inmunofluorescencia, la inmunohistoquímica, la citometría de flujo, la RT-PCR cuantitativa, el western blotting y el perfilado transcriptómico proporcionan enfoques complementarios para definir fenotipos asociados al linaje. Los análisis funcionales pueden evaluar además la fusión celular, la migración, la invasión, la adhesión y las interacciones con la matriz extracelular, permitiendo interpretar la expresión de marcadores moleculares junto con el fenotipo celular.
Para el STB, la formación de sincitio y los cambios moleculares asociados a la fusión son particularmente informativos, mientras que los estudios de EVT incorporan comúnmente ensayos de migración e invasión junto con la expresión de HLA-G y marcadores adicionales asociados al EVT. Combinar mediciones moleculares, morfológicas y funcionales es por tanto preferible a asignar la identidad del trofoblasto sobre la base de un único marcador.
Visión integrada de la diferenciación del trofoblasto
Colectivamente, los estudios experimentales apoyan un modelo en el que los mecanismos de diferenciación del trofoblasto surgen de una red interactiva de señalización dependiente de Hippo/TEAD4, BMP, Wnt/β-catenina, Notch, TGF-β/SMAD y HIF junto con factores de transcripción reguladores del linaje incluyendo CDX2, GATA3, TEAD4, TFAP2C y ELF5. La contribución relativa de cada vía depende de la especie, la etapa de desarrollo, el estado celular y el contexto experimental. Sus interacciones regulan el mantenimiento de las células madre del trofoblasto, el compromiso del linaje, la fusión del sincitiotrofoblasto y la invasión del trofoblasto extravelloso, mientras contribuyen a los programas celulares subyacentes al desarrollo placentario temprano.