Description

• Hot-start NeoTaq II DNA polymerase est une ADN polymérase modifiée présentant une activité de PCR de type « hot-start ».
• Une activité limitée à température ambiante contribue à prévenir l’extension non spécifique des amorces et la formation de dimères d’amorces.
• Permet d’obtenir une spécificité, une sensibilité et un rendement d’amplification PCR supérieurs.
• Activation en 5 minutes à 95 °C pour un démarrage rapide de la réaction.
• Permet l’amplification de matrices d’ADN allant jusqu’à 6 kb, avec des temps d’extension rapides de 15–30 s/kb.
• Nécessite une optimisation minimale de la PCR et permet une préparation de la réaction à température ambiante.
• Hot-start NeoTaq II DNA polymerase ne possède pas d’activité exonucléase 3′→5′ (activité de relecture).
• Génère des produits de PCR présentant des extrémités 3′ avec surplomb d’A, adaptés au clonage TA avec des kits de clonage PCR.

Conditions de stockage et préparation des réactifs

Ce produit doit être conservé entre -85 °C et -15 °C dans un congélateur sans cycles de dégivrage afin de garantir une durée de conservation maximale. Le produit reste stable jusqu’à la date d’expiration lorsqu’il est stocké dans les conditions spécifiées.

Contrôles de qualité

Pureté

La pureté de Hot-start NeoTaq II DNA polymerase est > 90 %, telle qu’évaluée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS, suivie d’une coloration au bleu de Coomassie.

Contamination par l’ADN génomique

Le produit doit respecter les critères internes relatifs à la contamination par l’ADN, évaluée par qPCR en temps réel.

Tests d’activité nucléasique

0,2–0,3 μg d’ADN plasmidique sont incubés avec 5 U de Hot-start NeoTaq II DNA polymerase, dans un tampon de réaction 1×, pendant 14–16 heures à 37 °C. Après incubation, l’ADN est visualisé sur un gel d’agarose coloré avec Safe DNA Gel stain. Aucune entaille (« nicking ») ni coupure visible de l’acide nucléique ne doit être observée. Des tests similaires sont réalisés avec le tampon Hot-start NeoTaq II et la solution de MgCl₂.

Test fonctionnel

Hot-start NeoTaq II DNA polymerase fait l’objet de tests approfondis de performance dans des réactions de polymérase en chaîne (PCR) visant à amplifier des fragments d’ADN de différentes tailles (1 et 2,5 kb) à partir d’ADN génomique humain. Les produits de PCR obtenus sont visualisés sous forme de bandes uniques sur un gel d’agarose coloré avec Safe DNA Gel stain. Des tests fonctionnels similaires sont réalisés avec le tampon Hot-start NeoTaq II et la solution de MgCl₂.

Dépannage

Absence d’amplification du produit ou faible rendement

• Température d’hybridation inadéquate

La composition du mélange réactionnel peut affecter les propriétés de fusion des amorces et de l’ADN. Ajuster la température d’hybridation en fonction de l’amorce présentant la température de fusion la plus faible (5 °C à 10 °C en dessous de la Tm).

• Présence d’inhibiteurs de PCR

Certaines procédures d’isolement de l’ADN, notamment celles utilisées pour l’isolement de l’ADN génomique, peuvent entraîner la copurification d’inhibiteurs de PCR. Réduire le volume d’ADN matrice ajouté à la réaction ou diluer l’ADN matrice avant son ajout au mélange réactionnel. Selon la concentration initiale en ADN, une dilution des échantillons allant jusqu’à 1:10 000 peut améliorer efficacement les résultats.

• Additifs nécessaires

L’ajout d’agents favorisant la PCR (solution 5× Optimizer ou solution 2× GC-Enhancer) peut améliorer le rendement tout en permettant l’amplification de matrices difficiles.

Présence de bandes non spécifiques

• Hybridation non spécifique des amorces

Ajuster les conditions d’hybridation et/ou concevoir une autre paire d’amorces en augmentant leur longueur et en évitant les séquences complémentaires.

• Concentration en Mg²⁺ trop élevée

En général, une concentration de 1,5–3 mM de MgCl₂, avec une concentration finale typique de 2,5 mM, convient à la majorité des réactions de PCR. La concentration optimale dépend de la matrice cible, du tampon et des dNTP. Optimiser la concentration en magnésium en ajoutant du MgCl₂ par incréments de 0,5 mM, jusqu’à 4 mM.