Verbrauchsmaterialien für Western Blot umfassen die Produkte, die benötigt werden, um Proteine von einem Elektrophoresegel auf einen festen Träger zu übertragen und anschließend immunologisch nachzuweisen. Die Western-Blot-Technik basiert auf dieser Übertragung auf eine Trägermembran, gefolgt von einer Immunerkennung, wodurch sie zu einer weit verbreiteten Methode zur Visualisierung und Identifizierung von Proteinen geworden ist. Diese Kategorie umfasst hauptsächlich Transfermembranen, Blotting-Filterpapiere, Transfer- und Waschpuffer sowie Blockierungs- und Nachweisreagenzien.
Hauptkomponenten
Der Transferträger besteht im Allgemeinen aus einem von zwei Materialien: Nitrozellulose oder Polyvinylidenfluorid (PVDF), die beide Proteine mit hoher Affinität binden. PVDF-Membranen müssen vor der Verwendung in 100 % Methanol benetzt werden, können anschließend jedoch mit einem Transferpuffer ohne Methanol verwendet werden. Blotting-Filterpapier aus 100 % Baumwollfasern sorgt für einen gleichmäßigen Pufferfluss durch das Gel und enthält keine Zusätze, die den Transferprozess beeinträchtigen könnten. Es ist in Standardstärke und besonders dicken Formaten erhältlich, wobei die dickere Variante aufgrund ihrer höheren Flüssigkeitsaufnahme besonders für Semi-Dry-Transfers empfohlen wird. Der beim Elektroblotting verwendete Transferpuffer besteht typischerweise aus Tris-Base, Glycin und Methanol (Konzentration abhängig vom jeweiligen Protokoll), während ein TBST-Waschpuffer (Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit 0,05 % Tween-20) und ein Blockierungspuffer (zum Beispiel 5 % Rinderserumalbumin) in den folgenden Schritten eingesetzt werden. Blockierungsreagenzien müssen alle nicht reagierten Stellen auf der Membran sättigen, ohne das Zielprotein zu verdrängen oder mit Antikörpern beziehungsweise Nachweisreagenzien zu interferieren.
Formate und Anwendungen
Vorgeschnittene Membranen und Filterpapiere sowie bereits zusammengesetzte Transfer-Sandwiches sind inzwischen verfügbar und direkt an die Gelabmessungen angepasst, wodurch das Verfahren vereinfacht und beschleunigt wird. Einige Systeme integrieren eine voraktivierte Transfermembran direkt in einen Verbrauchsstapel und ermöglichen dadurch einen Trockentransfer innerhalb weniger Minuten. Abhängig von der verwendeten Nachweismethode (kolorimetrisch, chemilumineszent oder fluoreszenzbasiert) kann die Wahl der Membran das Signal und den Hintergrund beeinflussen. Beispielsweise wurden PVDF-Membranen mit geringer Autofluoreszenz speziell entwickelt, um Hintergrundsignale bei fluoreszenzbasierten Nachweisen zu reduzieren. Der elektrophoretische Transfer kann unter nassen oder halb-trockenen Bedingungen durchgeführt werden, wobei der Nass-Transfer allgemein als zuverlässiger gilt, insbesondere bei größeren Proteinen, da das Risiko des Austrocknens des Gels verringert wird.
